在PVN（下丘脑腹侧部分）中，TLR4基因的缺失发生在CRH（促肾上腺皮质激素释放激素）神经元上，而非OXT（促性腺激素释放激素）神经元上，这会导致小鼠出现类似焦虑的行为和肥胖症状

《Brain, Behavior, and Immunity》：Loss of TLR4 on CRH neurons instead of OXT neurons in PVN induces anxiety-like behavior and obesity in mice

TLR4在PVN-CRH神经元中缺失导致焦虑和肥胖，而OXT神经元无显著影响，激活PVN-CRH→SuMM circuit可逆转焦虑。

　　

朱书青|周颖|叶子源|孙萌|舒刚|王松波|江清燕|王琳娜

中国广东省广州市天河区五山路483号，国家生猪与家禽育种产业重点实验室

摘要

Toll样受体4（TLR4）是一种参与先天免疫反应的模式识别受体；它广泛表达在中枢神经系统的微胶质细胞上，并参与炎症反应。然而，最近的研究表明，TLR4也表达在多种类型的神经元上，并参与情绪调节。CRH神经元和OXT神经元是调节焦虑的关键神经元，它们位于室旁核（PVN）中。我们发现TLR4参与了PVN中的焦虑调节，敲除PVN-TLR4显著增加了雄性和雌性小鼠的焦虑样行为。此外，PVN^{CRH-TLR4 KO}小鼠表现出更强的焦虑样行为并导致肥胖，而PVN^{OXT-TLR4 KO}小鼠在焦虑或肥胖方面没有显著变化。我们发现TLR4的缺失显著降低了CRH神经元的活性，PVN-CRH神经元向内侧乳头上核（SuMM）的核投射在调节焦虑中起关键作用。激活CRH到SuMM的投射回路可以显著逆转小鼠的焦虑样行为。我们的研究表明，是室旁核中CRH神经元而非OXT神经元中的TLR4缺失导致了焦虑和肥胖，而抑制CRH到SuMM的投射回路是产生焦虑的关键。

引言

Toll样受体4（TLR4）是一种由TLR4基因编码的跨膜蛋白（染色体位置：9），在先天免疫系统中作为病原体相关分子模式（PAMP）的识别分子。这种蛋白质主要表达在包括大脑、肝脏、心脏和脂肪在内的各种组织的细胞质膜上（Cuesta等人，2022年；Li等人，2021年；Shi等人，2023年；Zhang等人，2024年）。当TLR4与PAMP（如细菌脂多糖LPS和内毒素）结合时，会通过配体依赖性激活，从而启动经典的先天免疫信号通路并产生促炎细胞因子（Zhang等人，2022年）。TLR4在神经认知过程中发挥着多方面的作用，有助于学习和记忆巩固，介导与压力相关的神经适应，并参与神经退行性疾病的发病机制（Noelker等人，2013年；Okun等人，2012年）。值得注意的是，TLR4敲除（KO）小鼠表现出更多的焦虑样行为和减少的社会互动（Femenia等人，2018年）。先前的研究表明，TLR4主要表达在小鼠大脑的微胶质细胞中（Lehnardt等人，2002年）。然而，我们的研究显示TLR4也存在于多种神经元类型中，细胞特异性敲除实验表明它对调节进食行为、奖励处理和焦虑相关反应至关重要（Li等人，2021年；Li等人，2022年；Zong等人，2023年）。

据报道，焦虑与应激反应密切相关（Zveki?-Svorcan等人，2023年；Zvozilova等人，2024年；Zyga等人，2016年），特别是下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴在应激调节中的关键作用（Zuloaga等人，2024年；Swaab等人，2005年；Bao和Swaab，2010年）。大量实证证据表明，HPA轴的失调是焦虑障碍的重要病理基础。在中枢神经系统中，下丘脑的室旁核（PVN）是这方面的主要研究焦点（Zuloaga等人，2013年）。PVN中含有多种神经元类型，尤其是促肾上腺皮质激素释放激素（CRH）神经元、催产素（OXT）神经元和精氨酸加压素（AVP）神经元（Wei等人，2021年；Chen等人，2022年；Zhou等人，2008年）。这些不同的神经元类型对焦虑样行为有不同的调节作用，表明PVN是调节焦虑障碍的关键整合枢纽。然而，TLR4在PVN中的分布和功能尚未得到报道，也不清楚它是否与焦虑有关。

在这里，我们检测到了PVN中的TLR4表达。通过制备TLR4^flox/flox小鼠，并利用AAV hSyn-Cre在PVN中进行神经元特异性TLR4敲除，我们观察到雄性和雌性小鼠都表现出一致的焦虑样行为，说明不存在性别差异。此外，我们研究了两种参与焦虑调节的PVN神经元类型中的TLR4功能。通过使用带有CRH或OXT启动子的AAV载体（分别为AAV-CRH-Cre和AAV-OXT-Cre）进行细胞类型特异性敲除，我们发现CRH神经元中的TLR4缺失显著增加了焦虑样行为并导致肥胖，而OXT神经元中的TLR4缺失则没有这些效应。机制上，CRH神经元中的TLR4缺失降低了它们的神经元活性，这可能是导致焦虑表型的原因。最后，我们确定SuMM（内侧乳头上核）是PVN CRH神经元投射的关键下游靶点，表明PVN^CRH→SuMM神经回路可能介导TLR4依赖的焦虑调节。

实验部分

小鼠

CRH-ires-Cre（库存编号012704）和TLR4^f/f（库存编号024872）小鼠来自杰克逊实验室（美国缅因州巴港）。野生型C57BL/6小鼠来自珠海Bestest生物技术有限公司。

我们研究中使用的所有方案均获得了华南农业大学动物护理和使用委员会的批准，也符合华南农业大学实验动物中心的动物护理和使用指南。实验对象为8-12周大的成年雌雄小鼠

敲除PVN-TLR4会导致雄性和雌性小鼠出现焦虑

为了研究TLR4在室旁核中的功能，我们首先检测到PVN内侧有高水平的TLR4表达（图S1a）。随后培育了TLR4^f/f小鼠并进行了基因型鉴定（图S1b）。

为了研究TLR4在PVN中的功能，我们在具有PVN-TLR4敲除的雄性和雌性TLR4^f/f小鼠中使用了AAV2/9-hsyn-Cre-mCherry（作为对照）（图1a和S2a）。敲除后验证了TLR4的表达

讨论

我们认为PVN中的CRH神经元中的TLR4参与调节焦虑、食欲、体重和代谢。我们发现激活PVN中向SuMM投射的CRH神经元可以逆转由PVN中CRH神经元TLR4缺失引起的焦虑。

已有研究表明TLR4会增加焦虑和抑郁样行为的易感性（Cheng等人，2016年；Figueroa-Hall等人，2020年；Strekalova等人，2015年）。尽管许多研究将TLR4与炎症联系在一起

CRediT作者贡献声明

朱书青：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，数据可视化，实验设计，数据分析，概念构思。周颖：验证，实验设计。叶子源：实验设计。孙萌：实验实施。舒刚：软件使用，资源提供。王松波：软件使用，资源提供。江清燕：撰写 – 审稿与编辑，软件使用，资源提供，项目管理，资金获取，概念构思。王琳娜：撰写 – 审稿与编辑，软件使用，资源提供，项目协调

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

这些工作得到了国家重点研发计划（2022YFD1300401）和国家自然科学基金（32072779）的支持。S.Z.、Q.J.和W.L.负责实验的可视化与设计；S.Z.负责实验操作、数据采集与分析；Y.Z.、Z.Y.和M.S.参与了实验小鼠的制备和数据讨论；G.S.、S.W.、C.Z.、R.W.、Q.J.和L.W.提供了仪器、消耗品和分析工具；S.Z.和Q.J.也提供了支持。