壳聚糖是一种阳离子多糖，在生物医学领域因其可生物降解性、生物相容性、无毒性及抗菌活性而受到重视。然而，其较低的溶解度和聚集倾向限制了其应用范围。通过化学修饰可以解决这些问题，同时还能提升其生物性能。常见的酰化与烷基化方法往往在取代度（DS）的控制方面效果不佳。
本文报道了一种新的N-酰化方法，该方法使用六氟磷酸偶氮苯并三唑四甲基铀（HATU）作为偶联剂，在二甲基亚砜（DMSO）中进行反应。研究重点在于合成一种阳离子甜菜碱N-酰基壳聚糖衍生物N-(2-(N,N,N-三甲基氨基)乙酰)壳聚糖（TAC），并通过实验设计（DoE）方法优化了取代度的控制。
进行了两次包含12个实验的全因子DoE优化实验，调整了甜菜碱、HATU、1-羟基苯并三唑（HOBt）和三乙胺（TEA）的用量比例。TAC产品的取代度通过核磁共振（NMR）测定。优化后的方法仅需轻微过量的HATU即可实现甜菜碱的定量偶联，从壳聚糖原料合成TAC衍生物仅需3小时。该方法成功用于合成混合苯丙酰基、肉桂酰基和阿魏酰基TAC壳聚糖衍生物，但为了更广泛的应用还需进一步改进。抗菌实验验证了TAC对金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的抗菌效果。
壳聚糖是一种天然的线性β-1,4-连接的聚合物，由葡糖胺（2-氨基-2-脱氧-β-D-葡萄糖）和N-乙酰葡糖胺单体单元组成。它存在于某些真菌的细胞壁中（Másson, 2020），但市场上大部分壳聚糖是通过在碱性条件下对甲壳类动物的几丁质进行脱乙酰化获得的。
壳聚糖在多个领域具有广泛应用前景，包括生物医学（Sumiyoshi & Kimura, 2010）、农业和环境科学（Aranaz et al., 2021; Rinaudo, 2006）。该聚合物在人体内被认为是无毒、生物相容且可生物降解的（Másson, 2021），并具备多种有益特性，如免疫调节、抗菌和抗真菌作用（Aranaz et al., 2021; Másson, 2021; Rinaudo, 2006; Sumiyoshi & Kimura, 2010）。
壳聚糖的抗菌性能最早于1950年被发现（Fujimoto & Tomita, 1950），至今仍是研究热点，因为它对革兰氏阳性和阴性细菌以及冠状病毒和诺如病毒等病毒均有效（Helander et al., 2001; Másson, 2021; Matica et al., 2019; Muzzarelli et al., 1990; Rathinam, Solodova, et al., 2020; Sudarshan et al., 1992）。尽管壳聚糖抑制细菌生长的具体机制尚不清楚（Másson, 2021），但研究表明，在多阳离子状态下其抗菌效果更显著。此外，壳聚糖还能调节机体对感染的免疫反应（Helander et al., 2001; Másson, 2021; Rathinam, Solodova, et al., 2020）。
大量研究探讨了未改性壳聚糖的抗菌特性，重点关注其酰化程度和分子量的变化（Melleg?rd et al., 2011; Sahariah et al., 2019; Younes et al., 2014）。壳聚糖常被交联或与其他材料结合，制成液体制剂、水凝胶、涂层、微粒和纳米颗粒（Aam et al., 2010），应用于农业（Orzali et al., 2017）、水处理（Bhatnagar & Sillanp??, 2009）、食品（Wen et al., 2021）和医疗保健（Shariatinia, 2019）等领域。
然而，壳聚糖在pH值高于7的碱性水溶液中的溶解度较低，高分子量壳聚糖容易聚集（Chambers et al., 2019），而低分子量壳聚糖虽然溶解性好，但对细菌和真菌的抗菌效果较弱（Másson, 2024）。化学修饰可通过引入极性或带电基团来改善其在宽pH范围内的溶解性（Sajid et al., 2018），同时增强抗菌活性和治疗指数，选择性杀伤微生物并减少对哺乳动物细胞的毒性（Qin & Li, 2020）。
最常见的修饰策略是对1,4-连接的葡糖胺单体上的三个亲核位点（2-NH2、3-OH和6-OH）进行烷基化或酰化。然而，控制反应以实现化学和区域选择性修饰、提高试剂转化率以及达到理想的取代度（DS）颇具挑战性。Wang等人（Wang et al., 2021）的研究表明，使用NaOH作为催化剂合成羟丙基壳聚糖（HPC）时，并未出现预期的O-取代现象；详细NMR分析显示28–40%的N-取代发生，且不同反应间的DS和N/O比值存在显著差异。此外，超过5%的环氧丙烷烷基化试剂未能转化为目标产物。
另一种常见的壳聚糖衍生物是N,N,N-三甲基壳聚糖（TMC）。TMC合成通常追求选择性N-烷基化，但高取代度常伴随O-甲基化。Sieval等人（Sieval et al., n.d.）使用碘甲烷作为试剂、1-甲基-2-吡咯烷酮（NMP）作为溶剂和NaOH作为碱，在两步反应中获得了60%的三甲基化及显著的O-甲基化。Benediktsdóttir等人（Benediktsdóttir et al., 2011）发现，使用叔丁基二甲基硅基（TBDMS）保护羟基可实现对TMC的100% N,N,N-三甲基化。不过，这种方法步骤繁琐、产率低且聚合物分子量大幅降低（Sahariah et al., 2014）。实验设计（DoE）也被用于优化TMC合成条件，例如使用NaHCO3或二异丙基乙胺-胺（DIPEA）在N,N-二甲酰胺（DMF）或DMF/H2O溶剂中的反应，最终实现了68–72%的N,N,N-三甲基化及60%的碘甲烷转化率（Nagy et al., 2024a; Nagy et al., 2024b）。
N-酰化也是将羧基官能团引入壳聚糖的常用方法，常用于氨基酸（Ishii et al., 1995）、脂肪酸（Le Tien et al., 2003）和抗氧化剂（Nagy & Másson, 2020）等天然物质的偶联。壳聚糖的N-酰化可通过酸酐或酰氯反应实现，但最常用的方法是使用碳二亚胺偶联剂（如1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺（EDC）来活化羧酸并形成酰胺键。然而，当使用过量EDC时，N-酰基壳聚糖衍生物的转化率和取代度往往较低（Christ et al., 2021）。此外，许多分离和纯化方法未包含基于离子交换或透析的步骤，可能导致N-酰化取代度被高估（Christ et al., 2021; Reis et al., 2021）。我们在2021年的研究中使用EDC和羟苯并三唑（HOBt）在DMSO中成功合成了N-酰基壳聚糖衍生物（Sahariah & Másson, 2022）。
碳二亚胺偶联也被用于肽合成（Sheehan & Hess, 1955）。近年来，更高效的偶联剂如六氟磷酸偶氮苯并三唑四甲基铀（HATU）受到青睐（Shome et al., 2023），但这些方法仅适用于非水溶液。HATU介导的偶联也常用于小分子合成（Xiao et al., 2009）。HATU可作为N-酰基壳聚糖衍生物合成的替代试剂。
一种值得注意的N-酰基壳聚糖衍生物是N-(2-(N,N,N-三甲基氨基)乙酰)壳聚糖（TAC），也称为壳聚糖N-甜菜碱。与TMC类似，TAC含有季铵基团，但N-乙酰基间隔基团将它们与壳聚糖主链分离（Fig. 1）（Holappa et al., 2006; Rathinam, ólafsdóttir, et al., 2020）。
该衍生物具有强抗菌活性（Holappa et al., 2006; Rathinam et al., 2023; Rúnarsson et al., 2010; Sahariah et al., 2018），可作为吸收增强剂（Mannila et al., 2009），并在基因传递（Rúnarsson et al., 2010）和药物递送（Pandya et al., 2020）方面具有潜力。
TAC的合成主要采用羟基保护基团策略，如三苯基甲基（Gao et al., 2009; Holappa, Nevalainen, et al., 2006）或TBDMS保护基团（Rathinam, ólafsdóttir, et al., 2020），随后在有机溶剂中进行N-酰化反应并脱保护得到最终产物。尽管这种方法反应控制精确且取代度高，但过程耗时较长且试剂消耗量大。
本研究旨在开发一种更高效的N-酰化方法，使用HATU在DMSO溶剂中合成TAC（Scheme 1），实现甜菜碱的完全转化并精确控制取代度。通过实验设计（DoE）优化反应条件，缩短反应时间并减少昂贵的HATO试剂的使用量。该方法还扩展到合成具有两种不同N-酰基取代基的混合衍生物，评估其在一步法合成复杂衍生物中的潜力。同时，评估了TAC衍生物对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度（MIC），以验证其抗菌效果。
材料
实验所用壳聚糖来自冰岛Primex公司，分子量（MW）为270 kDa，平均单体MW为172.58 g/mol，酰化度（DA）为18%，通过NMR和GPC测定（Rathinam, Solodova, et al., 2020）。壳聚糖寡糖（COS）来自中国青岛海海生物技术公司（Qingdao Hehai Biotech），MW为340–1630 Da，酰化度为6.5%，同样通过NMR和GPC分析确定。
TAC合成优化
本研究旨在优化N-酰化过程，提高TAC的合成效率并精确控制取代度。我们之前报道的方法（Rathinam et al., 2020）步骤繁琐，需要制备三种中间体且耗时较长。此外，该方法需使用大量昂贵试剂。
结论
本研究开发了一种快速高效的TAC衍生物合成方法，相比以往的多步工艺具有显著优势（Gao et al., 2009; Holappa et al., 2006; Rathinam et al., 2023; Rathinam, ólafsdóttir, et al., 2020; Rathinam, Solodova, et al., 2020; Rúnarsson et al., 2010; Sahariah et al., 2014）。该方法简化为一步法，无需使用O-保护基团，显著提高了效率。
CRediT作者贡献声明
卢卡·普罗蒂（Luca Protti）：负责撰写初稿、验证、方法学设计及实验研究。薇薇安·纳吉（Vivien Nagy）：负责审稿与编辑、方法学设计及实验研究。丹尼尔·阿马尼（Daniel Amani）：负责审稿与编辑、实验研究。桑卡尔·拉蒂纳姆（Sankar Rathinam）：负责审稿与编辑、实验研究。埃尔瓦尔·厄恩·维克托松（Elvar ?rn Viktorsson）：负责审稿与编辑。马尔·马松（Már Másson）：负责审稿与编辑、监督工作及资金筹集、概念构思。
写作过程中使用的人工智能声明
作者使用Word、Grammarly和ChatGPT工具提升文本的语法、句法和写作风格。完成后，作者对内容进行了仔细审查和修改，并对最终发表成果负全责。
利益冲突声明
作者声明不存在可能影响本文研究的财务利益或个人关系。卢卡·普罗蒂表示获得冰岛大学药学系的资助；马尔·马松表示获得冰岛研究中心的资助。其他作者亦声明不存在此类情况。
致谢
本研究得到了冰岛技术发展基金（Icelandic Technical Development Fund）Rannis项目2422760-601和冰岛大学研究基金博士项目RSJ2025-96462的支持。
