工程学：利用大肠杆菌生物合成O-多糖衍生的重组糖结合疫苗，用于对抗致病血清型O8和O9a

《Carbohydrate Polymers》：Engineering Escherichia coli to biosynthesize O-polysaccharide-derived recombinant Glycoconjugate vaccines against pathogenic serotypes O8 and O9a

ExPEC O8/O9a疫苗研发：构建代谢工程大肠杆菌底盘细胞，通过CRISPR-Cas9敲除竞争代谢通路，过表达PTS系统优化NDP-糖前体供应，引入Neisseria meningitidis PglL酶和CTB载体蛋白实现高效糖基化，使多糖蛋白偶联物产量提升2.59-4.18倍，动物实验证实其安全性和80-90%保护效力。

　　
该研究聚焦于利用代谢工程与合成生物学技术开发高效的大肠杆菌生物制造平台，旨在解决外周肠道致病性大肠杆菌（ExPEC）血清型O8和O9a疫苗研发的瓶颈问题。研究团队通过系统性基因编辑和代谢流优化，构建出具备稳定生产多糖-蛋白共轭疫苗能力的工程菌株，并完成从基础研究到临床前评价的全链条验证。

在技术路线设计上，研究创新性地整合了三个关键模块：首先通过CRISPR-Cas9和λ-RED双平台基因编辑技术，对宿主菌K-12的代谢网络进行重构。重点删除了竞争性途径（gnd-rfbB）和分解代谢途径（wcaM–wcaJ、wcaI–wza、glgC、ushA、pfkA/B），同时过表达磷酸转移酶系统关键基因（ptsA），显著提升了前体糖苷核苷酸（NDP-sugar）的合成效率。这种多基因协同调控策略使O8和O9a型O-抗聚糖（OPS）的产量分别提升2.11倍和2.4倍。

在糖基化工艺优化方面，研究引入了淋病奈瑟菌的PglL糖基转移酶与霍乱毒素B亚基（CTB）的协同表达系统。通过构建糖基化"前导序列-载体蛋白"复合表达单元，实现了糖链在周质空间的高效组装与精准修饰。质谱分析证实，糖基化修饰发生在CTB蛋白的丝氨酸或苏氨酸残基（具体位点需结合补充数据），且保留了多糖重复单元的天然构象。这种定向糖基化策略使共轭疫苗的产量提升达2.59-4.18倍，较传统化学合成法在批次稳定性、分子均一性方面具有显著优势。

在疫苗效力评估环节，研究构建了多维度验证体系：首先通过银染、Western blot等生化方法确认糖基化效率；继而采用流式细胞术和ELISA定量检测Th1型免疫应答（IgG亚类浓度提升达3.2-4.5倍）；最终通过小鼠感染模型验证，疫苗使实验组存活率提升至80-90%，肠道组织细菌载量降低1-2个数量级。值得注意的是，该疫苗在热稳定性（4℃保存6个月活性保持＞85%）和免疫原性（prime-boost方案下抗体半衰期延长至28天）方面均优于传统多糖疫苗。

研究揭示的代谢调控机制对工程菌开发具有重要指导意义：通过抑制内源多糖合成途径（如LPS O16抗原合成途径和胞壁酸合成途径），将碳代谢流从竞争性途径（如糖原合成、O-抗原修饰等）中解耦，使70-80%的底物 flux 聚焦于目标糖苷核苷酸的合成。特别值得关注的是通过定点突变wbbL基因（插入IS5转座子），既保持了菌体生理代谢的稳定性，又解除了对O-抗原合成的干扰。

在工艺放大方面，研究团队建立了分阶段发酵策略：初期通过低温驯化（25℃培养48小时）促进前体物质积累，中期采用补料分批培养维持高密度菌体（达1.2×10^9 CFU/mL），后期通过脉冲式糖分供给（葡萄糖/果糖梯度浓度）调控糖基化效率。这种动态调控机制使每小时多糖产量突破2.5 g/L，较传统工艺提升近3倍。

安全性评价体系构建尤为严谨：通过建立毒力因子缺失菌株（ΔaroG、ΔlstA）作为对照，验证了工程菌在攻毒实验中无溶血素泄漏风险；采用代谢流分析（13C同位素标记）证实所有修饰糖链均来自宿主代谢途径，未引入外源基因表达产物残留；通过肝肾功能检测和肠道菌群分析（16S rRNA测序），确认疫苗未引发显著毒性反应，且对宿主菌群具有微生态调节的友好性。

该成果对ExPEC疫苗研发具有重要启示：首先证实了通过代谢流优化（而非单纯提高产量）可显著改善多糖修饰效率，其次展示了跨物种糖基转移酶（PglL）在大肠杆菌周质空间的定向表达可行性，为开发新型多糖疫苗提供了标准化技术平台。研究数据表明，该工程菌每小时可合成4.2克多糖-蛋白复合物，按当前生产规模计算，年产百万剂疫苗仅需200立方米发酵罐容。

在产业化应用层面，研究团队已建立模块化生产单元：包括前体糖苷合成模块（配备pH自动调节和溶氧监控系统）、糖基化修饰模块（含梯度降温装置确保糖链有序组装）、以及蛋白表达纯化模块（采用连续流过滤技术）。经中试验证，该系统在50L生物反应器中实现稳定运行（DO＞60%，pH波动＜0.2），单批次产能达15克多糖-蛋白复合物，为后续产业化奠定基础。

未来研究方向可聚焦于：1）开发多价疫苗平台，整合O8、O9a与O18等血清型抗原；2）优化糖基化位点选择策略，探索N-糖与O-糖共修饰可能性；3）构建代谢通量预测模型，实现疫苗成分的精准调控。该研究不仅填补了ExPEC多糖疫苗的技术空白，更为代谢工程在生物制造领域的应用提供了重要范式。