《Environmental Technology & Innovation》：Breaking the Matrix: Novel Phages Disrupt Resilient
Pseudomonas aeruginosa Biofilms and Enhance Chemical Disinfection on ICU Surfaces
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本研究针对ICU环境中铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）生物膜难以清除的难题，开展了新型噬菌体筛选及其协同消毒剂应用的研究。团队成功分离出四株新型烈性噬菌体（AM.P2、AM.P3、AM.P4、AM.P5），证实其对浮游菌和生物膜均具有显著清除效果（抑制率最高达100%），且与过氧化氢类消毒剂（ICUD1）序贯使用可提升成熟生物膜清除率至88.3%。该策略为医院环境生物膜污染控制提供了创新性解决方案。
在医院的重症监护病房（ICU）中，看似洁净的不锈钢床栏、仪器托盘和瓷砖地面，可能潜藏着致命的“隐形堡垒”——铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）生物膜。这种机会性病原体以其强大的环境生存能力和耐药性著称，尤其擅长在物体表面（即“fomites”）形成一层黏稠的、由胞外聚合物（EPS）构成的生物膜基质。这层基质如同坚固的盔甲，能有效阻挡化学消毒剂的渗透，使得常规消毒手段（如酒精、季铵盐、过氧化氢等）效果大打折扣，有时甚至需要将消毒剂浓度提高100至1000倍才能杀灭膜内细菌。这不仅导致消毒成本高昂，还可能筛选出耐消毒剂甚至耐抗生素的菌株，加剧抗菌素耐药性（AMR）危机。尽管出现了紫外线（UV-C）、汽化过氧化氢（HPV）等“非接触式”自动化消毒技术，但它们存在照射盲区、需要密闭环境、停机时间长、操作成本高等局限。因此，开发一种能够有效穿透并瓦解生物膜、且环境友好的新型消毒策略，已成为医院感染控制领域迫在眉睫的需求。
在这一背景下，噬菌体（Bacteriophages）——一种能够特异性感染并裂解细菌的病毒——因其独特的优势而重新进入研究人员的视野。它们数量庞大、易于分离、成本低廉、作用特异，且能自我复制。更重要的是，许多噬菌体编码诸如解聚酶（depolymerases）之类的酶，可以降解生物膜的EPS基质，为后续的杀菌作用打开通道。基于此，由Ambily Vasudevan、Abhijith Pulimoottil Jaykumar等人组成的研究团队在《Environmental Technology》上发表了一项研究，旨在探索利用新型噬菌体来对抗ICU环境表面的铜绿假单胞菌生物膜，并评估其与常用化学消毒剂联用的协同效果。
为了系统回答上述问题，研究人员采用了多项关键技术。他们从印度喀拉拉邦的污水处理厂样本中分离并纯化了三株新型铜绿假单胞菌噬菌体（AM.P3, AM.P4, AM.P5），并复活了此前已分离的一株（AM.P2）。通过透射电子显微镜（TEM）观察了噬菌体的形态特征。利用Illumina和Nanopore测序技术对噬菌体基因组进行测序和组装，并通过PhageScope、PhaBOX、ResFinder等生物信息学工具进行了基因组注释、系统发育分析、生活方式预测以及抗菌素耐药性（AMR）和毒力基因筛查。采用DepoScope管道对噬菌体编码的潜在解聚酶进行了预测。通过在不同温度（4°C至100°C）和pH（4至12）条件下孵育噬菌体，评估了其理化稳定性。核心实验包括：在取自ICU环境的不锈钢和瓷砖片上评估噬菌体对浮游态铜绿假单胞菌的杀灭效果；通过结晶紫（Crystal Violet）染色法和场发射扫描电子显微镜（FE-SEM）观察，评估噬菌体对生物膜形成（抑制）和成熟生物膜（破坏）的作用；比较了噬菌体鸡尾酒（四种噬菌体等比例混合）与两种ICU常用消毒剂（ICUD1：加速过氧化氢；ICUD2：季铵盐化合物）单独及序贯使用（先噬菌体后消毒剂）对成熟生物膜的清除效率。
3.1. 新型噬菌体的分离、形态与宿主特异性
研究人员成功分离出三株新型噬菌体（AM.P3, AM.P4, AM.P5），它们均能在宿主PAO1菌苔上形成清晰的噬菌斑。电镜观察显示它们都属于有尾噬菌体目（Caudoviricetes），具有二十面体的头部和尾部结构。宿主范围试验证实这三株噬菌体均高度特异性地针对铜绿假单胞菌。重要的是，所有四株噬菌体（包括AM.P2）在4°C至60°C的温度范围和pH 4至10的酸碱度范围内均表现出良好的稳定性，但在100°C和pH 12条件下完全失活，这表明它们能够适应医院环境多变的物理化学条件。
3.2. 基因组与系统发育分析
基因组测序揭示了一个有趣的现象：AM.P3和AM.P5是基因组大小分别约为280.1 Kb和279.9 Kb的“巨型噬菌体”（Jumbo Phages），而AM.P4（73.2 Kb）则与AM.P2大小相似。系统发育分析将两株巨型噬菌体归类为PhiKZvirus属，而AM.P4属于Luzseptimavirus属。生物信息学分析确认所有噬菌体均为烈性（lytic）噬菌体，且基因组中不含有AMR基因和毒力基因，满足了环境应用的安全性前提。
3.3. 噬菌体编码解聚酶的计算机识别
通过DepoScope管道分析，在AM.P3和AM.P5中预测到了可能编码解聚酶的开放阅读框（ORFs），这暗示它们可能通过酶解EPS基质来破坏生物膜。而AM.P2和AM.P4中未发现明显的解聚酶编码基因，其抗生物膜作用可能更依赖于直接的细菌裂解。
3.4. AM.P2与AM.P4的比较基因组分析
尽管AM.P2和AM.P4在基因组大小和序列上高度相似（近乎克隆），但AM.P4在短期内表现出更强的抗生物膜能力。深入分析发现，两者共享绝大多数蛋白质，仅有一个小蛋白（AMP4_gp29）为AM.P4所特有，且该蛋白未发现与多糖降解相关的已知酶活性域。这表明表型差异可能源于基因表达调控或宿主互作动力学等细微因素。
3.5. 分离的噬菌体有效控制fomite表面的浮游态铜绿假单胞菌
在模拟ICU环境的钢片和瓷砖片上，所有噬菌体均能显著减少浮游菌数量。作用3小时后，在钢片上细菌存活率最低降至1.62%（AM.P4），在瓷砖片上AM.P4处理甚至实现了100%的清除（0%存活率），显示了噬菌体在无生命表面消毒的强大潜力。
3.6. 分离的噬菌体有效控制fomite表面的铜绿假单胞菌生物膜
在抑制生物膜形成方面，个体噬菌体和四株噬菌体组成的鸡尾酒均表现出显著效果，抑制率在67%至79%之间，其中鸡尾酒效果最佳（79.18%）。在破坏已形成的成熟生物膜方面，AM.P2和AM.P3表现突出，破坏率分别达到60.58%和74.90%。FE-SEM图像直观地证实了噬菌体处理后生物膜结构被显著破坏，细菌数量大幅减少。
3.7. 消毒剂与噬菌体对生物膜破坏的比较研究
研究发现，消毒剂ICUD1和ICUD2在2小时内对成熟生物膜的破坏率分别为39.6%和29.5%，而噬菌体鸡尾酒在3小时内的破坏率为27.5%。然而，当采用“先噬菌体后消毒剂”的序贯策略时，协同效应显著。特别是噬菌体鸡尾酒预处理3小时后再用ICUD1处理2小时，对成熟生物膜的破坏率高达88.3%，远高于任何单一处理。相比之下，噬菌体鸡尾酒与ICUD2序贯处理的协同效果较弱（45.5%）。
研究的讨论部分对上述结果进行了深入分析。本研究成功分离并表征了四株安全、稳定、有效的新型抗铜绿假单胞菌噬菌体。序贯处理策略（尤其是噬菌体+ICUD1）展现出的强大协同效应，其机制可能在于：噬菌体首先通过裂解细菌和/或酶解作用初步破坏生物膜结构的完整性，削弱了EPS基质的屏障功能，从而为后续化学消毒剂（如ICUD1中的过氧化氢）的渗透和杀菌作用创造了有利条件。ICUD1作为氧化性消毒剂，其本身对有机物的氧化作用有助于进一步瓦解EPS，与噬菌体的前期破坏形成互补。而ICUD2作为阳离子消毒剂，可能更容易被带负电的EPS成分吸附而难以深入，且其快速杀菌特性可能不利于噬菌体的复制和持续作用，导致协同效果较差。
综上所述，这项研究证实了将特异性噬菌体作为医院环境，特别是ICU表面生物膜污染控制的生物增强剂的可行性。将噬菌体（尤其是鸡尾酒制剂）整合到现有的消毒流程中，作为化学消毒前的预处理步骤，可以显著提升对顽固性铜绿假单胞菌生物膜的清除效果，且无需大幅改变现有操作规范。这种“生物+化学”的联合策略为解决医院环境生物膜污染这一长期挑战提供了一种创新、有效且具有良好转化前景的新途径。未来的研究可聚焦于在真实医院环境中验证其长效性、安全性以及对多菌种生物膜的作用效果。
