通过高灵敏度的单分子RNA原位杂交技术，揭示了Edwardsiella ictaluri在实验室斑马鱼中的垂直传播途径

《Fish & Shellfish Immunology》：Vertical transmission of Edwardsiella ictaluri in laboratory zebrafish revealed by highly-sensitive single molecule RNA in situ hybridization

本研究开发了一种高灵敏度的HCR-smFISH检测技术，首次在斑马鱼模型中发现爱德华氏菌通过卵壳垂直传播，证实NaClO表面消毒可有效清除卵表面病原体，并减轻子代感染炎症反应，为水产动物疫病防控提供新策略。

　　

王超凡|刘丽月|王侯鹏|雷江月|曾江|孙永华|叶丁

中国大连海洋大学渔业与生命科学学院，大连

摘要

Edwardsiella ictaluri（简称E. ictaluri）是一种重要的细菌病原体，会导致淡水水产养殖业遭受严重损失，并对实验室斑马鱼（Danio rerio）群体构成新的威胁。尽管先前的研究表明E. ictaluri可能存在代际或垂直传播的现象，但直接支持这一假设的实验证据仍然缺乏。在这项研究中，我们开发了一种基于杂交链反应增强型单分子荧光原位杂交（HCR-smFISH）的技术，能够实现对宿主组织中E. ictaluri的高度敏感的单细胞和单分子水平检测。利用已建立的斑马鱼感染模型，我们研究了该病原体在关键免疫和代谢器官（包括脾脏、鳃和肝脏）中的组织嗜性和空间分布。值得注意的是，全胚胎成像直接证明了细菌的母体传播途径，显示细菌信号附着在卵子的绒毛膜表面。后续的消毒试验表明，使用NaClO进行表面杀菌可以有效消除与卵子相关的细菌，并减轻后代的感染引起的炎症反应。总体而言，这些发现填补了关于E. ictaluri垂直传播的关键知识空白，并为疾病预防、亲鱼管理以及在研究和水产养殖环境中建立无特定病原体的斑马鱼品系提供了实际指导。

引言

水产养殖是全球食品安全和经济稳定的关键支柱，但其发展一直受到传染病的阻碍。尤其是细菌病原体，每年造成的经济损失高达数十亿美元[1]。其中，Edwardsiella ictaluri这种苛养的革兰氏阴性细菌是鲶鱼（Ictalurus punctatus和Pangasianodon hypophthalmus）肠败血症的致病菌。近年来，该病原体也日益影响罗非鱼（Oreochromis属），在疫情爆发期间的死亡率可达50-100%[2]、[3]。病原体通过黏膜表面（包括胃肠道、鳃和皮肤）侵入宿主体内，从而实现快速全身扩散并在环境中持续存在[4]。

传统的E. ictaluri诊断方法依赖于细菌培养、生化分析和基于聚合酶链反应（PCR）的检测技术。尽管这些方法被广泛采用，但它们存在显著缺陷：基于培养的鉴定方法需要48-72小时，且灵敏度不稳定[5]；基于PCR的检测方法虽然更快，但只能确认细菌核酸的存在，无法提供关于病原体在宿主组织中的空间分布或载量的信息[6]。更重要的是，无法在关键器官（如生殖腺）中可视化病原体的位置，这阻碍了对潜在垂直传播途径的理解，导致肠败血症疫情反复发生[7]。

荧光原位杂交（FISH）技术通过使用荧光标记的探针与完整组织中的物种特异性RNA序列结合，克服了空间限制，实现了病原体的可视化、定量和定位[8]。然而，传统的FISH方法在检测低丰度目标（如E. ictaluri）时存在信号放大不足、自荧光干扰以及探针在密集组织中渗透性有限等问题[9]。这些技术障碍需要更先进的FISH方法来实现单病原体的检测。

在这里，我们开发了一种针对E. ictaluri检测优化的单分子FISH（smFISH）平台。通过设计多重酶放大探针和背景抑制算法，我们的方法实现了接近单细菌水平的灵敏度。我们将该方法应用于斑马鱼感染模型（该模型已被验证适用于肠败血症研究[10]），发现E. ictaluri在卵巢和睾丸组织中大量定植。后续的跨代实验证实了通过卵子的垂直传播，后代即使未通过水传播也表现出全身感染。

至关重要的是，我们验证了使用次氯酸钠（NaClO）对卵子表面进行消毒（0.05%，10分钟）是一种低成本且可扩展的方法，可以消除与卵子相关的细菌信号，且对胚胎存活或早期发育没有明显的不良影响。我们的工作不仅为水生病原体的诊断提供了革命性的工具包，还揭示了一个隐藏的传播途径，从而重塑了肠败血症的管理范式。通过将基于smFISH的垂直传播阻断技术整合到孵化场规程中，我们提供了确保水产养殖可持续发展的可行策略。

实验动物

本实验使用的斑马鱼为野生型AB品系，来自中国斑马鱼资源中心（隶属于国家水生生物资源中心CZRC-NABRC，武汉）。这些斑马鱼在28°C、14小时光照/10小时黑暗的光周期下饲养，每天三次喂食新孵化的Artemia nauplii直至饱食[11]。

所有涉及动物的实验程序均经过水生生物学研究所动物伦理委员会的审查和批准。

E. ictaluri斑马鱼感染模型的建立

注射了三种不同浓度E. ictaluri（1×10⁵、1×10⁴和1×10³ CFU/mL）的斑马鱼出现了死亡现象。所有感染组的死亡率都与对照组存在差异（图1A）。

在1×10³ CFU/mL组中，仅有一条斑马鱼在注射后第6天死亡；在1×10⁴ CFU/mL组中，死亡开始于第5天，并从第6天到第8天急剧增加，最终到第10天的存活率仅为10%；而在1×10⁵ CFU/mL组中，死亡情况更为迅速

讨论

本研究开发了一种高度敏感的HCR-smFISH检测方法，实现了对宿主组织中E. ictaluri的单分子水平可视化。将该先进诊断工具应用于斑马鱼模型后，发现了之前未被认识的生殖腺嗜性，并提供了细菌通过卵子绒毛膜传播的直接视觉证据。重要的是，我们验证了使用NaClO进行表面消毒是一种实用且有效的干预措施，可以消除这种病原体

CRediT作者声明

王超凡：方法学、验证、数据分析、调查、可视化、撰写 - 初稿；刘丽月：资源准备；王侯鹏：验证、调查；雷江月：调查；曾江：可视化；孙永华：概念设计、撰写 - 审稿与编辑、监督、项目管理、资金获取；叶丁：概念设计、数据管理、撰写 - 审稿与编辑、监督、项目管理、资金获取。

数据获取

数据可应要求提供。

资助

本研究得到了国家重点研发计划（项目编号：2023YFF0724602、2022YFF0710502）、湖北省自然科学基金（2025AFA053）、武汉市自然科学基金（2024040701010069）、海南省科学技术专项基金（ZDYF2024XDNY256）以及国家重点实验室“育种生物技术和可持续水产养殖”跨学科研究团队项目（2024BBSA01）的支持。