《Food Chemistry》：Impact of covalent interactions between caffeic acid and rice bran albumin on protein structure and function
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稻米枝蛋白（RBA）与咖啡酸（CA）共价结合通过碱性条件，改变了蛋白的二级结构和表面疏水性，显著提升了抗氧化活性（ABTS提高48.52%，DPPH提高33.08%），并增强其泡沫性和乳化性能。体外消化显示CA修饰促进RBA水解。研究证实共价键合能有效改善RBA的功能特性，适用于食品工业开发。
郭梦琳|张冉|张晨歌|梁富强|史嘉怡
南京财经大学食品科学与工程学院，中国南京210023
摘要
为了研究植物蛋白与酚酸之间的共价相互作用及其对米糠利用的改善作用，本研究在碱性溶液中将米糠白蛋白（RBA）与咖啡酸（CA）进行了共价复合。研究了RBA–CA复合物的结构、界面性质、抗氧化活性以及体外消化模拟结果。SDS-PAGE实验表明白蛋白分子发生了交联；SEM、FTIR和ANS荧光实验结果显示，咖啡酸的修饰改变了蛋白质的二级构象和表面疏水性。RBA–CA复合物表现出较高的抗氧化活性，其中咖啡酸修饰后ABTS自由基清除率提高了48.52%，DPPH自由基清除率提高了33.08%。此外，中等和低浓度RBA–CA复合物的起泡性和乳化性能也得到了改善。体外消化实验表明，添加咖啡酸会加速RBA的水解过程。这些发现表明，咖啡酸与RBA的共价结合增强了蛋白质在食品应用中的功能性。
引言
米糠蛋白是一种营养价值高且致敏性低的食用蛋白。米糠白蛋白（RBA）是米糠蛋白中最丰富且营养价值最高的成分（Yang等人，2018年），具有较高的营养价值和优异的消化性能（Peng等人，2017年）。然而，尽管米糠的年产量可观，但其工业利用仍然有限。与许多植物蛋白一样，天然RBA的乳化和起泡能力较弱（Kim等人，2024年）。这严重限制了RBA在特定食品领域的应用潜力。因此，通过修饰植物蛋白来提升其技术性能对于其在食品工业中作为有前景和创新成分的持续发展至关重要。植物蛋白与多酚的相互作用能够增强抗氧化活性并改变蛋白质结构（Kim等人，2024年）。
咖啡酸（CA）是羟基肉桂酸的衍生物，对人体无毒（Sharma等人，2024年），并具有多种生物活性，包括抗氧化（Khan等人，2016年）、抗炎（Li等人，2019年）、抗菌（Pinho等人，2015年）、神经保护和肝脏保护作用。研究表明，咖啡酸与蛋白质的相互作用可以提高蛋白质的热稳定性、DPPH自由基清除能力（Qin等人，2021年）和起泡性能（Chang等人，2021年）。目前关于RBA与咖啡酸共价结合的研究还相对较少。因此，本研究探讨了不同浓度咖啡酸对RBA的共价修饰效果。
人们对蛋白质与多酚相互作用的研究兴趣日益增加。蛋白质与多酚之间可以通过非共价和/或共价机制发生相互作用（Yang等人，2023年）。与非共价相互作用相比，共价键更强且不可逆，使得多酚能够更有效地与蛋白质结合（Liu等人，2021年）。多酚与蛋白质的共价结合主要通过多酚羟基醌与蛋白质中的亲核残基反应实现，这种反应会导致蛋白质的交联和聚合（Li等人，2021年）。植物蛋白与多酚的共价结合通常在碱性条件下进行，尤其是在pH≥9的条件下，会导致蛋白质结构发生显著变化（Kim等人，2024年）。已有研究表明，蛋白质与多酚的结合会改变蛋白质的结构（Shi等人，2024年），并显著提高其界面活性、乳液稳定性和抗氧化稳定性（Xu等人，2022年）。这些先前的研究证实了多酚通过共价结合在调节蛋白质功能性质方面起着重要作用。
结合速率通过Folin–Ciocalteu方法测定，结构变化通过荧光和FTIR光谱进行分析，并评估了共价结合的影响。本研究重点关注了不同浓度咖啡酸的作用以及RBA在食品工业中的应用。
材料
米糠从元旺富硒品牌购买，并在-20°C下保存以提取白蛋白。咖啡酸由上海阿拉丁生物科技有限公司提供。所有其他试剂均为分析级。
RBA的提取
RBA的提取方法参考了Yang等人（2018年）的方法，并进行了一些改进。将脱脂米糠（100克）置于0.8升蒸馏水中，在40°C下使用磁力搅拌器提取2小时，然后离心分离上清液和沉淀物。
咖啡酸的结合速率
在碱性环境（pH 9.0）下，咖啡酸容易被氧化形成醌类物质，与蛋白质中的氨基酸残基发生反应，形成稳定的共价键，最终形成稳定的共价复合物（Karefyllakis等人，2017年）。如表1所示，随着咖啡酸浓度的增加，结合速率显著提高（p<0.05）。由于蛋白质的量是固定的，因此结合能力达到饱和状态后不再增加。
RBA-CA复合物的粒径和Zeta电位
随着咖啡酸浓度的增加，复合物的粒径首先
结论
本研究揭示了咖啡酸与RBA的共价结合有效地改变了蛋白质的结构构型，并显著提升了其功能特性，尤其是在高浓度咖啡酸的情况下。结构分析证实了RBA–CA复合物通过共价键成功形成，导致分子构象发生明显变化，这些变化与复合物优异的乳化和起泡性能密切相关。此外，抗氧化活性也得到了提高。
作者贡献声明
郭梦琳：撰写初稿、软件使用、方法设计、数据分析。
张冉：实验研究、数据分析。
张晨歌：实验研究、数据分析。
梁富强：撰写、审稿与编辑、实验指导。
史嘉怡：撰写、审稿与编辑、实验指导、项目管理和资金申请。
利益冲突声明
作者声明不存在可能影响本文研究的已知财务利益或个人关系。
致谢
本项工作得到了江苏省自然科学基金（BK20231304）和江苏省高等教育机构重点学术发展计划（PAPD）的支持。
