淀粉是一种天然的多糖类碳水化合物，是绿色植物中的主要能量储存形式。它广泛存在于谷物、块茎和豆类中。淀粉的性质主要由其植物来源决定。淀粉糊化在食品、制药、造纸、纺织和化工等多个领域得到广泛应用，主要利用其吸水、膨胀以及形成粘性胶体浆液的特性。然而，实际应用中淀粉糊的稳定性较差（Punia, 2020; Punia Bangar, Ashogbon, Singh, Chaudhary, & Whiteside, 2022）。冷却后，它们往往无法形成具有足够弹性和强度的透明凝胶，同时还会出现显著的粘度波动和流动性差的问题。在储存过程中，淀粉糊容易发生返生（淀粉分子重新排列成结晶结构），导致粘度增加和浑浊。此外，经过反复冻融循环的淀粉糊容易发生渗出（水分分离），导致质地不均匀和冻融稳定性差。这些限制显著影响了淀粉糊在各种应用中的性能。因此，提高淀粉糊的稳定性对于扩大其用途至关重要（Meng et al., 2025; Xu, Ye, Zuo, & Fang, 2022）。
氧化淀粉是通过用氧化剂处理天然淀粉制备得到的。这一过程将葡萄糖单元上的羟基氧化为羰基，随后这些羰基和羧基可以进一步转化为羧酸基。引入的羰基和羧基所带的负电荷会产生相互排斥作用，从而改善糊液的透明度和冻融稳定性（Vanier, El Halal, Dias, & da Rosa Zavareze, 2017）。氧化淀粉的制备方法包括化学法、物理法和酶法。然而，化学方法通常使用次氯酸钠或高锰酸盐等氧化剂，需要金属催化剂，并会产生有毒副产物和废气（Maniglia, Castanha, Le-Bail, Le-Bail, & Augusto, 2021）。
酶修饰作为一种高效、底物特异性强且环保的方法，越来越受到关注。然而，一个显著的缺点是，传统上酶修饰通常需要依次应用两种或更多种酶才能获得目标产物（Kumari & Sit, 2023）。这是因为不同酶的最佳反应条件（如pH值、温度）往往不同，无法在同一反应系统中同时进行。因此，该过程需要在第一个酶步骤后中断反应，更换缓冲系统，并调整温度以适应后续酶的作用。这不仅延长了反应时间，降低了效率，还可能导致中间产物的损失。因此，克服酶的局限性并提高协同催化效率是酶工程中的关键研究方向。已经探索了酶固定化、定向进化及酶融合等技术来优化酶的性能（Hwang & Lee, 2019; Rudjito et al., 2024）。其中，酶融合技术在广泛应用方面具有很大潜力。通过将多个酶结构域基因融合到单一多肽中，可以增强底物通道效应，并显著提高催化位点之间的中间体局部浓度，从而产生协同效应。例如，CBM20与环糊精葡萄糖转移酶的融合显著降低了酶对可溶性淀粉的米氏常数（Km）并提高了其催化效率（X. Jia et al., 2017）。Adlakha, Sawant, Anil, Lali, 和 Yazdani Syed (2012) 通过将β-葡萄糖苷酶与β-1,4-内葡聚糖酶连接，构建了一系列双功能嵌合蛋白，其中一种嵌合蛋白（EG5）的催化效率是单独重组酶的两倍。这些研究为通过合理设计融合酶来实现淀粉的协同修饰提供了明确的先例和理论框架。
先前的研究表明，先使用β-淀粉酶处理再使用己糖氧化酶（HOX）氧化可以获得具有更好应用性能的氧化淀粉，验证了“水解-氧化”方法的可行性（Li et al., 2024）。
麦芽四糖形成淀粉酶（G4-淀粉酶）是一种属于糖苷水解酶家族13（GH13）的外切作用淀粉酶。它特异性地依次切割淀粉底物非还原端的第四个α(1→4)糖苷键，生成麦芽四糖（Cui et al., 2024）。该酶包含一个催化结构域和一个结合结构域。G4-淀粉酶的碳水化合物结合模块20（CBM20）通过柔性连接子连接到催化结构域的C末端，表现出显著的内在不规则性和灵活性（Mezaki, Katsuya, Kubota, & Matsuura, 2001）。
己糖氧化酶（HOX）具有广泛的底物特异性，能够氧化葡萄糖、乳糖、麦芽糖、纤维二糖和葡萄糖寡糖（溶液中最多五个葡萄糖残基）（Hansen & Stougaard, 1997; Rand, Qvist, Walter, & Poulsen, 2006）。HOX可将底物葡萄糖分子C1位置的羟基氧化为相应的内酯，随后内酯自发水解为醛醇，同时分子氧被还原为过氧化氢（Li et al., 2024）。然而，HOX在结合大分子底物（如淀粉）时存在困难。它依赖于预水解生成较小的寡糖以实现有效氧化。这限制了HOX在氧化淀粉生产中的应用，因此提高其底物结合能力对于实现高效淀粉氧化至关重要。
碳水化合物结合模块（CBM）是结构和功能上独立的蛋白质结构域。虽然CBM本身没有催化活性，但它们能够靶向底物的催化结构域，促进有效的底物结合和催化。研究表明，CBM20不仅能够结合原始淀粉颗粒，还能破坏颗粒表面，从而有助于淀粉链与酶的结合（Christiansen et al., 2009; Jane?ek, Mare?ek, MacGregor, & Svensson, 2019; Southall, Simpson, Gilbert, Williamson, & Williamson, 1999）。为了克服天然酶的缺陷，可以通过将酶与其他蛋白质结构融合来赋予它们合适的共结构域。例如，4-α-葡聚糖转移酶被工程化与淀粉结合结构域（SBD）进行N端融合，使融合酶的水解活性提高了1.3–1.7倍（Wang et al., 2023）。受此启发，HOX的C末端与CBM20进行了融合，以增强己糖氧化酶的底物亲和力。
本研究通过将CBM20连接到己糖氧化酶的C末端，并通过柔性连接子与G4-淀粉酶连接，设计了一种融合酶（G/HCA）。这种结构旨在提高底物结合亲和力和催化效率。选择玉米淀粉（代表谷物）、豌豆淀粉（代表豆类）和木薯淀粉（代表块茎）作为模型底物。系统研究了经过G/HCA修饰的淀粉的结构和理化性质，并将其与G4-淀粉酶和HOX（GHA）的顺序处理方法进行了比较。我们假设G/HCA的修饰效率高于GHA，从而使得淀粉糊的稳定性更高。这为绿色高效地制备具有理想稳定性的淀粉基食品提供了一种新的酶学策略。
