利用自下而上的蛋白质组学分析方法检测核桃中是否混入了可食用坚果

《Food Chemistry》：Detection of adulteration in walnuts with edible nuts using bottom-up proteome analysis

核桃产品掺假检测通过微流液相色谱-离子迁移-四极杆飞行时间质谱联用技术实现，基于蛋白质组学分析鉴定出11个选择性标记肽，可可靠检测1%（w/w）以下掺假水平，并在独立测试集中达到100%准确率。

　　

萨米·维内加斯（Sammy Venegas）|安德烈亚斯·毛泽（Andreas Mauser）|塞维姆·达拉巴斯马兹（Sevim Dalabasmaz）|萨布丽娜·根斯伯格-赖格尔（Sabrina Gensberger-Reigl）|莫妮卡·皮谢特斯里德（Monika Pischetsrieder）

德国埃尔朗根-纽伦堡弗里德里希-亚历山大大学（Friedrich-Alexander-Universit?t Erlangen-Nürnberg, FAU）化学与药学系食品化学实验室，尼古拉斯-菲比格街10号（Nikolaus-Fiebiger-Str. 10），91058埃尔朗根（Erlangen, Germany）

摘要

本研究通过自下而上的蛋白质组学分析方法，识别了核桃产品中被其他可食用坚果（特别是腰果、榛子和花生）掺假的情况。样品中的蛋白质提取物经过蛋白酶消化后，采用微流控液相色谱-离子迁移率四极杆飞行时间质谱（microLC–IM–QTOF）技术进行检测，并进一步进行肽段分析。利用定制的蛋白质序列数据库对非靶向LC–MS/MS数据中的肽段进行优化鉴定，最终确定了腰果、榛子和花生这三种坚果的11种特异性标记肽。在添加了掺假物的核桃样品中，能够可靠地检测出低至1%（w/w）的掺假比例。通过将8个可能被掺假的独立测试样本与27个真实的参考样本进行比较，准确率达到了100%。所获得的非靶向LC–MS/MS数据可以在未来需要研究其他掺假物时，通过不同的蛋白质序列数据库进行重新处理。

引言

坚果制品是用于食品生产的高价原材料，例如用于涂抹酱、麦片或烘焙原料。像德国的“Elisenlebkuchen”这种高品质姜饼中就含有坚果作为有价值且独特的成分（Deutsche Lebensmittelbuch-Kommission, 2010）。特别是核桃，以其富含营养价值的脂质（Gao et al., 2024; Rébufa et al., 2022）和蛋白质（Sze-Tao & Sathe, 2000）而闻名。

作为具有全球供应网络且价格波动的农产品，加工过的坚果产品（如核桃）容易受到故意使用低成本替代品进行掺假的行为（Robson et al., 2021; Spink & Moyer, 2011）。因此，欧洲刑警组织（Europol, 2023）每年都会发起OPSON联合行动，打击食品领域的犯罪活动。例如，在OPSON VI行动中，德国当局查获了1.3吨含有8%花生杂质的榛子（Europol, 2017; Interpol & Europol, 2017）。由于核桃和较便宜的可食用坚果的成分相似，它们可以按比例互相替代（Venkatachalam & Sathe, 2006）。这种欺诈性替代行为在工业食品生产中可能难以通过常规的质量控制措施发现。除了造成经济损失外，坚果掺假还可能引入未声明的过敏原，从而对消费者构成健康风险（Bracker & Brockmeyer, 2018; Interpol et al., 2017）。

世界上许多国家都生产带壳和去壳的核桃。在过去四年中，有超过40个国家向联合国粮食及农业组织（FAO）报告了核桃的出口情况；其中30个国家的年出口量超过了100吨（FAO, 2024a, FAO, 2024b; Wu et al., 2020）。复杂的全球市场结构可能为食品掺假提供了便利，尤其是在核桃收获期较短的情况下，全球价格水平会波动（Chang & Zhongli, 2022; Martinez et al., 2010）。

通常使用实时或滴液数字聚合酶链反应（PCR）方法来分析坚果产品被其他坚果掺假的情况（Ito et al., 2018; Lanubile et al., 2024; Waiblinger et al., 2022）。PCR是一种基于特定引物的靶向方法，但难以适应新出现或快速变化的掺假物。通过化学计量策略，利用（近）红外光谱（Arndt et al., 2020; Netto et al., 2023; Rovira et al., 2022）、核磁共振光谱（Schmitt, Bastek et al., 2020; Schmitt, Schneider et al., 2020）和电感耦合等离子体质谱（Segelke et al., 2020）等方法，已经成功验证了可食用坚果的地理来源和纯度。这些方法大多侧重于区分不同类型的核桃，且需要大量的真实参考样本。此外，还采用了多种直接的高分辨率质谱（HR-MS）方法来评估真实性，例如基质辅助激光解吸-飞行时间质谱（Kuckova & Kaderabkova, 2024）或实时质谱分析（Schmauder et al., 2024）。然而，这些方法的缺点在于光谱的反卷积以及分析物的鉴定较为复杂。高效液相色谱（HPLC）技术也被用于坚果的鉴定，例如结合紫外检测（Campmajo et al., 2019; Esteki et al., 2019）或（串联）质谱（Klockmann et al., 2016; Korte et al., 2016; Ruhland & Klinger, 2019）可以检测到非靶向代谢物模式或坚果过敏原的特异性生物标志物。然而，当需要检测其他掺假物时，这些方法的灵活性有限。

基于质谱的蛋白质组学技术已成功应用于食品 authenticity 验证（Carrera et al., 2024; Dou et al., 2023）。基于微流控液相色谱-离子迁移率四极杆飞行时间质谱（microLC–IM–QTOF）–MS的肽段分析能够生成直观易解释的非靶向原始数据，因为所需的序列信息可以从碎片光谱中提取（McCormack et al., 1997; Zhang et al., 2012）。这种方法结合了非靶向数据采集的优势（形成分子指纹）和基于标记化合物的成分分析优势（Bayen et al., 2024）。同时，通过标记肽段可以验证分离结果的准确性，避免因参考数据库不足导致的误判。数据以非靶向方式获取，可根据研究需求进行后续处理。对肽序列的深入分析有助于了解样品特性。此前，通过将获得的肽序列与蛋白质序列数据库比对，已可靠地确定了牛奶样品中的物种和/或热处理情况（Zenk et al., 2024）。由于蛋白质谱分析能够精确识别指示性肽信号，因此可以通过蛋白质数据库搜索验证这些信号的选择性。因此，不需要大量的真实样本训练集。此外，非靶向原始数据还可以在未来针对新出现的掺假物进行重新处理。

在本研究中，我们利用非靶向LC–MS/MS数据来专门识别核桃的真实性。分析旨在通过自下而上的蛋白质组学方法检测核桃样品中被其他可食用坚果掺假的情况。我们假设这种方法能够可靠地识别出假冒样品，并确定掺假物。

部分内容摘要

化学试剂

超纯水由德国达姆施塔特的Milli-Q Reference A+系统（Merck）制备，用于配制水溶液试剂/溶剂。Pierce BCA蛋白测定试剂盒和氢氧化钠（NaOH）购自德国施韦尔特的Fisher Scientific公司。乙腈（ACN；适用于微流控液相色谱-质谱级）、三（羟甲基）氨基甲烷盐酸盐（Tris-HCl）和二硫苏糖醇购自德国卡尔斯鲁厄的Carl Roth公司。甲酸（FA；适用于液相色谱-质谱级）购自德国达姆施塔特的VWR公司。

结果与讨论

为了可靠地验证核桃样品的真实性，本研究在溶液蛋白酶消化后开发并验证了一种基于数据库的肽段分析方法。

结论

通过自下而上的microLC–IM–QTOF–MS/MS蛋白质组学分析，获得了核桃基质中腰果、花生和榛子等可食用坚果掺假物的肽段信息。优化数据评估流程后，能够有效且直接地区分掺假物含量低于5%（w/w）的样品。随后，这些特征肽段被验证为选择性标记序列，在目标基质中具有满意的检测灵敏度。

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CRediT作者贡献声明

萨米·维内加斯（Sammy Venegas）：撰写 – 原稿撰写、可视化、方法设计、实验设计、数据分析、概念构思。安德烈亚斯·毛泽（Andreas Mauser）：撰写 – 审稿与编辑、方法设计。塞维姆·达拉巴斯马兹（Sevim Dalabasmaz）：撰写 – 审稿与编辑、方法设计。萨布丽娜·根斯伯格-赖格尔（Sabrina Gensberger-Reigl）：撰写 – 审稿与编辑、概念构思。莫妮卡·皮谢特斯里德（Monika Pischetsrieder）：撰写 – 审稿与编辑、监督、资金筹集、概念构思。

资助

本研究是在SHIELD研究网络的支持下完成的，该网络名为“通过感官检测方法确保国内（有机）食品的安全性”（SHIELD – Safe domestic (organic) food through sensory detection methods），得到了巴伐利亚研究基金会（Grant number 1491–20）和鲁道夫与亨丽埃特·施密特-布尔克哈特基金会（Rudolf and Henriette Schmidt-Burkhardt Foundation）的资助。我们对此表示衷心的感谢。资助机构未参与研究的设计、数据收集、分析和解释过程。

未引用参考文献

Perez-Riverol et al., 2025

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能影响本文研究工作的财务利益或个人关系。

致谢

我们感谢克里斯蒂娜·迈斯纳（Christine Meissner）对手稿的校对工作，以及贝亚特丽克斯·容格（Beatrix Jung）准备测试样本集的帮助。