《Innovative Food Science & Emerging Technologies》：Insight into the molecular mechanism underlying the improvement of functional properties in pea protein isolate by electron beam irradiation
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豌豆蛋白 isolate 电子束辐照处理通过破坏结构增强功能特性及机理研究
杨娜娜|李慧玲|尚关瑞宇|江天|雷宏杰
西北农林科技大学食品科学与工程学院，中国杨凌712100
摘要
豌豆蛋白分离物（PPI）是一种有前景的可持续植物蛋白来源，但其较差的功能特性限制了其在食品生产中的广泛应用。本研究旨在探讨电子束辐照（EBI）处理（2、4、6、8和10 kGy）对PPI结构和功能特性的影响，并阐明结构-功能关系。结果表明，EBI处理降低了PPI的粒径和浊度，同时提高了ζ电位的绝对值，表明其聚集行为减弱，这通过扫描电子显微镜（SEM）得到了验证。光谱结果显示，EBI处理使蛋白质发生 unfolding，但未破坏肽链骨架和亚基组成，暴露出内部疏水基团，主要表现为自由-SH基团、H0含量的增加以及无序卷曲结构的增加，而α-螺旋和β-折叠结构的比例减少。因此，与对照组相比，EBI处理后的PPI具有更好的溶解性、起泡性和乳化性能。皮尔逊相关性分析进一步证实，EBI处理通过调节蛋白质结构改善了其功能特性。此外，使用EBI处理后的PPI制备的乳液表现出粒径减小和表面电荷增加，从而在4°C下储存15天后稳定性得到提高。这些结果表明，EBI是一种改善PPI功能特性的有效技术，为其在食品工业中的广泛应用提供了理论基础。
引言
近年来，消费者对动物产品替代品的需求迅速增长，推动了植物蛋白市场的蓬勃发展（Teng等人，2023年）。PPI由球蛋白（70-80%）和白蛋白（10-20%）组成，由于其均衡的氨基酸组成、可持续性、无过敏原性和非转基因特性，被认为是经济且适合消费者的动物蛋白替代品（Chen等人，2022年；Teng等人，2023年；Zhi等人，2022年）。全球PPI市场也在逐年增长（Liu等人，2024年）。PPI富含对人体必需的氨基酸，如精氨酸、苏氨酸、异亮氨酸和亮氨酸，尤其是赖氨酸，而其他谷物中赖氨酸含量有限（Qu等人，2023年；Zhang, Liu等人，2022年）。PPI具有多种健康益处，包括调节肠道微生物群、抗炎作用和降低血压（Jiang等人，2022年）。然而，PPI中球蛋白的比例较高，导致其水溶性较低，这与11S甘氨酸蛋白和7S维西林的存在有关（Wang, Wang等人，2023年）。11S甘氨酸蛋白是由碱性亚基和酸性亚基通过二硫键连接形成的六聚体（Chen等人，2022年）。7S维西林是由α、β和γ亚基通过疏水相互作用连接的三聚体（Teng等人，2023年）。这些刚性结构导致蛋白质结构紧凑且灵活性低，从而引起蛋白质聚集。这种行为直接影响了PPI的溶解性和功能特性，限制了其在食品生产中的应用（Bai, Li等人，2024年；Qu等人，2023年；Yan等人，2025年）。因此，迫切需要改进PPI以扩大其在食品生产中的应用。
蛋白质的功能特性主要由其构象和聚集行为决定，这些特性可以通过修饰来调节（Teng等人，2025年）。已经采用了多种酶法、化学法和物理法来增强蛋白质的功能性能（Dong等人，2024年；Glusac & Fishman，2021年）。相比之下，物理修饰因其高安全性、低成本、营养损失少和处理时间短而被广泛采用（Li等人，2024年；Rout & Srivastav，2024年）。非热技术，包括冷等离子体、脉冲电场、高压均质化和超声波，也被用于蛋白质修饰（Du等人，2022年；Ma等人，2023年；Tang等人，2024年；Teng等人，2025年）。Liu等人（2024年）使用冷等离子体修饰PPI，发现RONS与PPI之间的相互作用显著改变了PPI的二级和三级结构，使其二级结构更加稳定和有序，从而显著提高了PPI的持油能力、凝胶化和乳化性能。Rout和Srivastav（2024年）的研究表明，高压介电屏障放电大气冷等离子体产生的活性氧介导的氧化通过改变PPI的二级和三级结构，显著改善了其乳化性能。此外，修饰后的PPI还表现出更好的流变性和蠕变恢复性能。脉冲电场也被用于蛋白质修饰，可以将蛋白质构象从有序状态转变为更灵活的无序状态，从而显著提高其溶解性、界面活性和乳化性能（Hu等人，2024年；Teng等人，2025年）。Melchior等人（2022年）发现，高压均质化通过促进PPI unfolding，使其溶解性和持油能力得到提高，形成的乳液流变特性从液态假塑性转变为凝胶状塑性。超声波也被证实可以通过促进蛋白质 unfolding和暴露隐藏的极性和疏水基团来提高PPI的溶解性（Zhang, Liu等人，2022年）。尽管上述方法可以通过构象修饰在一定程度上改善蛋白质的功能特性，但它们也有一定的缺点。例如，高压均质化的高生产成本和有限的可扩展性，以及长时间超声处理导致的蛋白质热聚集和变性，限制了其在蛋白质修饰中的应用。此外，冷等离子体和脉冲电场可能导致金属污染和电极降解，因为电化学反应（Jia等人，2026年）。脉冲电场的穿透能力较弱，主要用于液体样品的修饰（Hu等人，2024年；Teng等人，2025年），这增加了冻干时间和成本。冷等离子体在处理粉末或厚样品时容易产生热点和死区，导致样品处理不均匀。因此，迫切需要探索新的非热技术来改善蛋白质的功能特性。
电子束辐照（EBI）是一种新型的非热电离辐照技术，由于其低成本、高效率、安全性和环保性而广泛应用于蛋白质修饰（Bai, Li等人，2024年；Shen等人，2024年；Zhang, Feng等人，2022年）。EBI修饰蛋白质的主要机制是高能电子束的直接电离效应和间接产生的自由基反应（Wang等人，2017年）。EBI处理主要利用加速器产生的高能电子束直接与蛋白质碰撞，通过破坏分子间力诱导蛋白质 unfolding和肽链断裂（Han等人，2026年）。此外，高能电子束在蛋白质电离过程中产生大量活性自由基（Li等人，2019年）。这些自由基攻击蛋白质侧链上的氨基酸残基，破坏侧链间的相互作用，导致蛋白质 unfolding（Zhang, Feng等人，2022年）。产生的自由基还可以与其他分子反应，从而破坏蛋白质二级结构中的氢键网络，断裂二硫键，并引起蛋白质的氧化修饰（Han等人，2026年）。EBI处理引起的蛋白质结构变化主要表现为隐藏的非极性基团的暴露、有序结构（α-螺旋和β-折叠）比例的降低以及无序卷曲结构的增加。这些结构变化显著影响了蛋白质的功能特性（Chen等人，2024年；Han等人，2026年；Zhang, Feng等人，2022年）。Zhang, Feng等人（2022年）指出，低剂量辐照可以通过降低α-螺旋和β-折叠的比例来调节鹰嘴豆蛋白的溶解性、乳化性能和耐热性。Li等人（2019年）还发现，EBI修饰可以通过诱导蛋白质 unfolding和增加构象灵活性来改善大米蛋白的功能特性。Han等人（2026年）证明，EBI处理破坏了羊蹄胶原蛋白的结构，暴露出隐藏的非极性基团，同时增加了无序结构，从而提高了溶解性、乳化性能、表观粘度和剪切应力。Liu等人（2019年）和Chen等人（2024年）均证实了EBI在增强蛋白质抗氧化能力方面的有效性。Wang等人（2019年）提出，构象变化，包括蛋白质 unfolding、交联、聚集和重排，可能是小麦胚芽蛋白乳化性能提高的根本原因。这些研究表明，EBI是一种经济、安全且有前景的蛋白质修饰技术。Wang等人（2017年）使用EBI预处理豌豆蛋白，然后进行Flavourzyme酶解，评估了EBI处理对豌豆蛋白水解物功能特性的影响，还研究了EBI处理对豌豆蛋白水解物表面疏水性和分子量分布的影响。然而，本研究主要探讨了EBI处理对豌豆蛋白水解物抗氧化活性和功能特性的影响，未探讨其对PPI结构、聚集行为和功能特性的影响。此外，EBI处理后PPI的结构-功能关系尚不清楚。
因此，本研究在不同剂量（2、4、6、8和10 kGy）下对PPI进行了EBI处理，并通过测量溶解性、粒径、ζ电位、浊度和微观结构观察初步研究了EBI修饰对蛋白质聚集行为的改善效果。随后，通过分析自由-SH基团、H0含量、荧光光谱、SDS-PAGE和FTIR来阐明EBI处理对PPI改善效果的潜在机制。进一步通过评估热稳定性、起泡性和乳化性能来确认这些改善效果。进行皮尔逊相关性分析以进一步阐明蛋白质结构与功能特性之间的相关性。最后，使用EBI处理的PPI来稳定乳液，并表征了所得乳液的粒径、ζ电位和储存稳定性。
材料
PPI购自中国上海的Yuanye公司。BSA、DTNB和ANS由北京Solarbio公司提供。还原型或非还原型蛋白质加载缓冲液（5×）和BCA试剂盒购自中国陕西的Zhhcbio公司。
EBI处理
10克PPI放入密封袋中压平至3毫米厚，然后分别进行2、4、6和10 kGy的辐照处理。未经过EBI处理的PPI作为对照组（Han等人，2026年）。
溶解性
样品在纯水中溶解至4毫克/毫升
溶解性
溶解性会影响蛋白质的功能特性（Jia等人，2026年）。如图1A所示，EBI处理后溶解性显著增加，这是由于PPI内部有序结构被破坏，暴露出更多的极性基团，增强了蛋白质与水之间的相互作用（Han等人，2026年）。这种结构变化通过FTIR得到证实，显示无序卷曲结构的比例增加，同时α-螺旋和β-折叠结构的比例降低（图5A）。
结论
本研究揭示了EBI处理对PPI功能特性的改善效果以及EBI处理后PPI的结构与功能特性之间的关系。结果表明，EBI处理对PPI结构和功能特性的改善是剂量依赖的。EBI处理改变了PPI的二级和三级结构，但未破坏肽链骨架和亚基组成。随着辐照剂量的增加
CRediT作者贡献声明
杨娜娜：撰写——原始草案、软件使用、方法学设计、概念构思。李慧玲：验证、数据分析、数据整理。尚关瑞宇：数据可视化、验证、数据分析。江天：撰写——审稿与编辑、监督。雷宏杰：撰写——审稿与编辑、验证、资源获取、资金筹措、数据整理。
未引用参考文献
Semba, Ramsing, Rahman, Kraemer和Bloem, 2021
利益冲突声明
作者声明没有利益冲突。
致谢
作者衷心感谢榆林市科技计划项目（2023-NY-343）提供的财政支持，以及西北农林科技大学生命科学研究核心服务（Kerang Huang）提供的技术支持。
