《aBIOTECH》：Visual marker–assisted gene editing of
MLO confers powdery mildew resistance in
Nicotiana alata
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本研究针对白花烟草(Nicotiana alata)栽培种'Jasmine'在弱光环境下易感白粉病导致观赏价值下降的问题，开发了首个无需抗生素标记的双重可视化CRISPR/Cas9基因编辑系统。通过敲除NalaMLO基因成功获得T1/T2代抗病株系，多组学分析揭示其抗性机制涉及MAPK信号通路、苯丙烷代谢等多途径协同调控，且不影响关键花香成分。该研究为观赏作物抗病育种提供了新技术平台。
白花烟草(Nicotiana alata)作为全球花卉产业链中具有重要观赏价值的茄科植物，其栽培品种'Jasmine'因花朵洁白、花期长且具有茉莉花香而备受青睐。然而在设施栽培和室内绿化条件下，光照不足往往导致该品种极易感染白粉病，引发叶片霉变、黄化萎蔫等问题，造成观赏价值急剧下降。传统化学防治不仅增加生产成本，还带来农药残留等环境问题，因此培育抗病品种成为产业可持续发展的关键。
尽管现代植物转化和基因组编辑技术为实现精准性状改良提供了可能，但在白花烟草中的应用却面临两大技术瓶颈：一是基因型依赖的再生困难限制了规模化遗传操作；二是传统转化系统依赖抗生素抗性标记，缺乏实时可视化筛选手段，导致阳性转化子鉴定效率低下。此前研究曾尝试在白色花品种中利用拟南芥花青素调控基因AtPAP1建立可视化转化系统，但因该品种花青素合成通路存在遗传缺陷而失败。
为解决这些难题，云南民族大学王伟光、胡秋芬团队在《aBIOTECH》发表了题为"Visual marker–assisted gene editing of MLO confers powdery mildew resistance in Nicotiana alata"的研究论文。该研究通过建立稳定的叶盘再生体系，开发了基于花青素积累和白化表型双重可视化的CRISPR/Cas9基因编辑系统，成功实现了白花烟草MLO基因的精准编辑，为观赏作物抗病育种提供了新技术路径。
研究人员主要采用以下关键技术：首先通过叶盘外植体培养优化建立了高效的再生体系；其次利用农杆菌介导法进行遗传转化，并引入AtPAP1和NtAN2作为可视化标记；进而构建了三种CRISPR载体（pNala-SpCas9、pNala-SpG、pNala-SpRY）并评估其编辑效率；最后通过接种实验、多组学分析和挥发性成分检测综合评价抗病性和农艺性状。
2.1 稳定叶盘再生系统的建立和农杆菌介导转化的优化
通过优化植物激素配比，发现MS培养基添加3 mg/L 6-BA和0.5 mg/L NAA可实现>95%的愈伤组织诱导率，而2 mg/L 6-BA和0.5 mg/L NAA组合可获得>50%芽分化率。比较四种农杆菌菌株发现，GV3101和LBA4404转化效率最高（约95%），且污染率较低。GFP荧光检测证实转化成功，为后续基因编辑奠定了基础。
2.2 可视化标记辅助基因编辑系统的建立
研究人员在粉花、柠檬绿花和白花三个栽培种中成功实现AtPAP1和NtAN2介导的花青素积累，证明花青素标记在不同花色背景下的普适性。构建的三种CRISPR载体中，pNala-SpCas9编辑效率达58.8%，且通过花青素积累（转化标记）和白化表型（编辑标记）实现双重可视化。SpG和SpRY变体分别拓展了NGN型和NNN型PAM识别范围，但编辑效率低于野生型SpCas9。
2.3 NalaMLO编辑赋予白粉病抗性
通过同源比对鉴定出NalaMLO基因，利用pNala-SpCas9系统在'Jasmine'品种中获得21株编辑植株，其中5株为纯合突变。接种菊科白粉菌(Golovinomyces cichoracearum)后，野生型植株发病等级达9级，而编辑株系仅0-1级，表现出显著抗病性。通过去除紫色幼苗成功获得无转基因成分的T1代纯合编辑植株。
2.4 NalaMLO编辑介导的白粉病抗性机制探索
接种后20天的动态观察显示，编辑株系病斑扩展显著受限。转录组分析发现26,689个差异表达基因，KEGG富集显示MAPK信号通路、淀粉蔗糖代谢、苯丙烷生物合成等途径显著激活。代谢组鉴定到640个差异积累代谢物，其中螺环查尔酮C等抗菌物质上调。蛋白质组分析发现1,308个差异表达蛋白，与转录组结果相互印证。值得注意的是，MLO互作蛋白（钙调蛋白、肌球蛋白XI等）的表达水平未发生显著变化。
2.5 NalaMLO基因编辑对香气成分的影响
HS-SPME-GC/MS分析显示，编辑株系仍保留179种花香挥发物，关键香气成分如芳樟醇、苯乙醇和D-柠檬烯含量与野生型无显著差异。主成分分析表明两组样本化学轮廓高度重叠，证明MLO编辑未影响花卉观赏品质。
2.6 Nalamlo农艺性状评价
编辑株系在株高、单株种子产量、莲座期鲜重等农艺性状上与野生型无显著差异，成熟植株外观和蒴果发育也保持正常，表明抗病性的获得未伴随产量代价。
研究结论与讨论部分指出，该研究成功整合了高效再生系统、农杆菌转化优化、通用可视化标记和PAM扩展基因编辑等技术，建立了白花烟草遗传改良平台。首次证实SpG/SpRY变体在该物种中的可行性，尽管其编辑效率较低且存在自编辑风险。多组学数据表明NalaMLO缺失可能通过多途径协同调控抗病反应，但需进一步通过多时间点采样和功能验证明确因果关系。该技术平台在保持观赏品质的前提下显著提升白粉病抗性，为其他观赏作物抗病育种提供了重要参考。未来完成茉莉品种基因组测序将有助于全面评估编辑特异性和商业化应用安全性。
