引言
成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关蛋白(Cas)系统是细菌和古菌中广泛存在的可遗传RNA介导的免疫系统。通过基因工程改造，科学家们建立了广泛应用的CRISPR/Cas9、CRISPR/Cas12和CRISPR/Cas13碱基编辑系统。在单向导RNA(sgRNA)的引导下，Cas9蛋白利用其HNH和RuvC样核酸酶结构域切割靶DNA，产生双链断裂(DSB)。DSB激活受体细胞启动修复通路，包括非同源末端连接(NHEJ)或同源重组(HDR)，从而导致可遗传的突变，如缺失、插入或替换（图1A）。
尽管基于CRISPR/Cas9的基因敲除潜力巨大，但其主要依赖NHEJ，存在几个挑战，包括不可控地产生不同类型的突变以及较高的脱靶风险。为了满足对更精确、多功能基因编辑工具的需求，研究人员将Cas9开发为蛋白质支架。随后，基于CRISPR的激活、抑制、碱基编辑和引物编辑技术相继出现，开启了精准基因组编辑的时代。
碱基编辑器(BE)相较于先前的基因组编辑方法具有三个关键优势：与传统CRISPR/Cas9系统相比，通过在不形成DSB的情况下产生单核苷酸修饰，提高了精确度；与表观遗传工具不同，能够产生永久性可遗传突变；与引物编辑系统相比，使用更简单的表达盒时效率更高。这些特性使碱基编辑特别适用于精准育种和治疗应用。
BEs是通过将单链DNA(ssDNA) Cas9切口酶(Cas9n)与碱基脱氨酶融合而设计的，从而能够在目标窗口内进行碱基修饰而不形成DSB（图1B）。BEs增强的安全性使其在动物疾病模型和治疗性基因编辑中具有重要价值。
在植物研究中，碱基编辑主要用于产生用于研究基因组功能或用于分子育种的突变材料。对植物基因组和基因功能的研究已经鉴定出许多与连续性状突变相关的单核苷酸多态性(SNP)位点和启动子基序，这些位点使用CRISPR/Cas DSB难以修饰。
主要类型的碱基编辑器
单碱基编辑器
单碱基编辑器特异性地将靶位点的一种碱基转换为另一种。这些编辑器使用特定的酶修饰底物碱基，随后通过错配修复或糖基化酶消化产生脱嘌呤/脱嘧啶(AP)位点，从而实现精确的碱基修饰。单碱基编辑器有多种类型。根据其主要修复通路，单碱基编辑器可分为AP位点依赖型或AP位点非依赖型。
AP位点非依赖型特异性碱基编辑器
AP位点非依赖型碱基编辑器通过底物碱基脱氨产生脱氨碱基中间体，并依赖于跨损伤合成(TLS)聚合酶的宽松碱基识别能力。该机制可产生特定的碱基替换，包括CBE实现的C-to-T替换和ABE实现的A-to-G替换。CBE和ABE代表了最先进的单碱基编辑器，因其高效率、广泛适用性和精确的编辑结果而在动植物研究中获得广泛应用。
胞嘧啶碱基编辑器(CBE)
CBE是科学研究中最早使用的单碱基编辑器。第一个此类碱基编辑器BE1由哈佛大学的David Liu团队通过将dCas9与高活性大鼠胞苷脱氨酶rAPOBEC1融合而开发。dCas9-rAPOBEC1融合蛋白在sgRNA引导下，在靶位点的编辑窗口内通过脱氨作用将胞嘧啶(C)转化为尿嘧啶(U)。在DNA复制或修复过程中，U被解读为胸腺嘧啶(T)，相应的鸟嘌呤(G)被转化为腺嘌呤(A)，从而实现C•G到A•T的定向转换（图2）。
为了提高编辑效率，该研究团队随后在BE1的基础上开发了BE2到BE4，显著提高了CBE的性能。BE2通过在BE1中加入尿嘧啶糖基化酶抑制剂(UGI)来保护脱氨产生的尿嘧啶免受内源性尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG/UNG)的水解，从而提高了编辑效率。在BE3中，dCas9被仅切割ssDNA的Cas9n取代。这一变化确保靶点上的C脱氨形成U的同时，消除具有原始序列的互补链，从而防止U通过HDR修复通路恢复为C。BE4包含更多拷贝的UGI，增强了对U的保护，从而显著提高了编辑效率并减少了副产物的产生。BE3和BE4的建立为CBE的进一步优化提供了关键框架。
TadA-8e（一种腺嘌呤特异性脱氨酶）进化出能够进行胞嘧啶脱氨的变体是一项重大研究突破。研究人员使用噬菌体辅助连续进化(PACE)系统筛选了能够脱氨胞嘧啶的TadA变体（TadA-CD、TadA-CDe）。他们引入了N46和Y73点突变，开发了CBE6，实现了更高的编辑效率并减少了非C-to-T碱基替换副产物的产生。TadA8e进化的胞嘧啶脱氨酶具有几个优势：它们比天然胞嘧啶脱氨酶更小，保持高编辑效率，并且脱靶率显著降低。此外，它们更窄的编辑窗口有助于实现高精度的胞嘧啶碱基编辑。
腺嘌呤碱基编辑器(ABE)
ABE包含自然界中不存在的腺嘌呤脱氨酶TadA。自然系统中存在作用于游离腺嘌呤、腺苷和RNA腺苷的腺嘌呤脱氨酶；然而，它们不作用于双链DNA或ssDNA中的腺嘌呤碱基。Gaudelli等人通过易错PCR和在多种抗生素上进行选择，对大肠杆菌中tRNA特异性腺嘌呤脱氨酶进行定向进化，构建了ABE7.10，最终开发出ssDNA腺嘌呤脱氨酶TadA7.10。ABE7.10是哺乳动物细胞中的腺嘌呤碱基编辑系统，可产生A-to-G转换。ABE的作用模式与CBE相似：腺苷脱氨酶通过脱氨作用将A转化为肌苷(I)，而I在修复过程中转化为G。互补链上相应的T转化为C，实现A•T到G•C的定向转换。ABE的主要优势在于I和G的结构相似性，这导致由切除引起的插入或缺失(indel)极少，从而实现更精确的腺嘌呤碱基编辑（图2）。
AP位点依赖型随机碱基编辑器
依赖AP位点的BEs主要通过碱基切除修复(BER)通路发挥作用。它们利用糖基化酶消除脱氨产生的中间碱基或直接作用于底物碱基以产生AP位点。随后，TLS聚合酶或DNA连接酶修复这些AP位点，随机替换为其他碱基。或者，AP裂合酶去除AP位点，引起DSB并引入indel。通过AP位点修复产生的编辑产物主要取决于细胞修复机制和所使用的修复相关酶。在真核细胞中，特定碱基被替换的趋势顺序为C > G > A > T。目前，编辑产物的纯度相对较低，碱基转换类型表现出高度随机性，难以人为控制。尽管如此，这类碱基编辑器的发展扩大了碱基编辑技术的应用范围。
C-to-G碱基编辑器(CGBE)
与CBE不同，C-to-G碱基编辑器(CGBE)通过外源表达尿嘧啶糖基化酶发挥作用，该酶切除胞嘧啶脱氨酶从胞嘧啶产生的尿嘧啶。这种切除产生AP位点，这些位点由DNA聚合酶或连接酶修复，导致碱基转换。2021年，Kurt等人将大肠杆菌同源UNG(eUNG)与BE4max融合，排除UGI，开发了CGBE1。该系统在哺乳动物细胞中产生大量C-to-G突变。类似地，Zhao等人使用UNG切除U并启动BER通路修复。通过将大肠杆菌UNG与APOBEC和nCas9融合，他们创建了APOBEC-nCas9-Ung，主要产生C-to-G突变，以及少量的C-to-A和C-to-T突变。研究人员将UNG变体转化为以C为底物的糖基化酶变体。这导致了不依赖脱氨酶的CBE的开发，例如DAF-CBE和gCBE。在植物中，Zeng等人将CGBE应用于水稻，开发了CGBE-rUNG和CGBE-hUNG。CGBE在植物中主要产生C-to-T突变，C-to-G和C-to-A突变较少。基于这些发展，另一种方法通过结构分析出现。Chen等人分析了ABE8e复合物及其与底物相互作用的结构，战略性地突变TadA8e中的关键氨基酸，包括V28、V30、N46和F84。他们产生了源自TadA8e (N46L)变体的C-to-G碱基编辑器(Td-CGBE)。该变体与UGI等融合，产生了编辑活性与BE4max相当的Td-CBE系列。
腺嘌呤交换碱基编辑器(AYBE/AKBE)
与ABE相比，AYBE（Y = T/C, K = T/G）通过外源表达嘌呤糖基化酶发挥作用，将细胞修复导向BER通路。该机制切除由TadA诱导的脱氧肌苷，产生AP位点，实现多样的碱基编辑转换。2023年，Tong等人将次黄嘌呤切除蛋白N-甲基嘌呤DNA糖基化酶(MPG)和ABE8e融合，开发了AYBE，可产生A-to-Y突变。他们优化了该蛋白，获得了AYBEv3，其编辑产物分布如下：A-to-C > A-to-K > indels (K = G/T)。这种编辑偏好可归因于TLS聚合酶（如Pol η）的参与，其优先催化非Watson-Crick碱基配对。当AYBE引入非天然碱基中间体（腺嘌呤脱氨产生的肌苷衍生物）时，Pol η倾向于将其识别为嘌呤类似物，导致A-to-C/T颠换频率增加。Tong等人证明过表达Pol η可增强A-to-T转换的效率和纯度。值得注意的是，AYBE编辑在植物中表现出不同的特性。将MPGv3与ABE融合后，该编辑器产生了A-to-G转换，仅有极少的A-to-T和indel。A-to-C突变几乎不存在。
胸腺嘧啶碱基编辑器(TBE, TSBE)
基于尿嘧啶结合口袋和与尿嘧啶底物相互作用的关键氨基酸基团，Ye等人使用易错PCR和细菌筛选定向改造人UNG，获得了一种以T为底物的DNA糖基化酶，即胸腺嘧啶-DNA糖基化酶(TDG3)。通过将该酶与Cas9n融合，他们构建了不依赖脱氨酶的TBE，在大肠杆菌中实现了T-to-A碱基交换编辑，在哺乳动物细胞中实现了T-to-G碱基交换编辑。同时，He等人使用蛋白质语言模型指导UNG进化，创建了增强的胸腺嘧啶靶向变体(eTDG)。该变体被用于开发高效的TSBE（S = G/C），促进T-to-S (G/C)编辑。
鸟嘌呤碱基编辑器(GBE)
基因组DNA中受损的G和A碱基经常发生脱嘌呤，并通过DNA糖基化酶产生AP位点。这一步启动了BER通路，导致突变。Tong等人将MPG进化为一种识别G为其底物的糖基化酶。工程化的MPG变体（T199R/S230R/Q294R/D295R）被用于开发GBE，可产生G-to-Y (Y=C/T)碱基转换。这一进展完善了碱基编辑系统的最后一块拼图。Wu等人通过将工程化的人尿嘧啶DNA糖基化酶变体与nCas9结合，开发了靶向胸腺嘧啶(pTGBE)和胞嘧啶(pCKBE)的不依赖脱氨酶的BEs。这些编辑器在水稻中实现了高达78.05%的T-to-G编辑效率和高达61.11%的C-to-G/T编辑效率，进一步扩展了植物中的碱基编辑工具箱。
总之，通过错配修复修饰的底物碱基产生的编辑产物是可预测的。相比之下，通过修复的AP位点产生的碱基转换仍然是不可预测的。AP位点非依赖型和AP位点依赖型BEs之间的主要区别在于产物纯度。AP位点非依赖型BEs表现出更高的纯度，更适用于精确的单碱基编辑。相比之下，AP位点依赖型BEs产生多样化的编辑产物，有助于构建丰富的突变库以研究基因功能。然而，BER通路会导致不可避免的indel副产物产生，因此不适合精确编辑。
双碱基编辑器(DBE)
除了识别基因差异和研究基因功能外，研究人员经常通过突变来探索基因的驯化和多样化。这通常需要在靶位点内产生多个碱基变化。单碱基编辑受脱氨酶底物使用的限制，限制了靶位点内的碱基转换数量，阻碍了复杂氨基酸修饰的生成。为了满足这些需求，开发了双碱基编辑器(DBE)。
关于DBE的研究最早于2020年在植物中进行。Li等人将胞嘧啶脱氨酶APOBEC3A、2×UGI和ecTadA-ecTadA7.10与CRISPR/Cas9n系统融合，从而在靶位点同时实现C-to-T和A-to-G碱基编辑。这种类型的DBE，称为饱和靶向内源突变编辑器(STEME)，被用于研究水稻中的OsACC基因，从而鉴定出影响除草剂抗性的关键位点。因此，DBE是用于饱和突变和定向进化的强大工具。此外，Liang等人将CGBE和ABE整合，开发了一种多功能双碱基编辑器，即AGBE，能够产生四种类型的碱基转换：A-G、C-G、C-T和C-A。这种方法大大增加了编辑产物的多样性，使其适用于构建饱和突变库。
与典型的基于蛋白质融合的DBE不同，Neugebauer等人利用噬菌体辅助连续进化系统将TadA突变为TadA-dual (R26G/V28A/A48R/Y73S/H96N)变体，该变体同时对其靶位点的胞嘧啶和腺嘌呤进行脱氨。Fan等人将该变体用于植物基因编辑，以确认其双碱基替换的效率，开发了一种称为TadDE的紧凑型植物双编辑器。这些DBE增加了单个靶位点内的突变丰度，并可适应更多的应用场景。
精确缺失基因组编辑器(AFID)
源自BEs的精确缺失基因组编辑器利用其功能元件识别并作用于靶位点内的特定碱基，产生可预测的小片段缺失。
2020年，Wang等人建立了一种新的多核苷酸靶向缺失系统，称为APOBEC-Cas9融合诱导缺失系统(AFID)。作者将野生型SpCas9与胞嘧啶脱氨酶APOBEC、UDG和AP裂合酶结合。该系统基于胞嘧啶脱氨和BER原理，产生从不同5′-胞嘧啶到Cas9切割位点的多核苷酸缺失。研究人员使用截短的APOBEC3B脱氨酶变体(A3Bctd)提高了可预测的缺失效率。随后，在2022年，Zeng等人通过引入内切核酸酶V(EndoV)，开发了一种基于选择性切除修复通路的系统，EndoV促进了核酸链内3′-肌苷磷酸二酯键的水解。作者将EndoV整合到ABE中，并实现了靶位点两个A之间的精确缺失。
精确缺失基因组编辑器主要通过切割和修复靶位点来发挥作用。这些基因组编辑器可用于分析基因组内的各种调控元件、功能基序和非编码DNA片段。
碱基编辑器的优化策略
基于CRISPR效应器底盘的选择
对基因编辑工具的更好理解导致了更多CRISPR效应器蛋白的发现，其中一些具有独特的特性和基本功能。当用作支架蛋白时，小的核酸酶可以有效地减小BEs的尺寸。
目前用于BEs的Cas蛋白包括Cas9（SpCas9-NGG, ScCas9-NNG, SaCas9-NNGRRT, CjCas9-NNNNRYAC）和Cas12蛋白（Cas12a-TTTV, Cas12b-TTTV, Cpf1-TTTV, Cas12j-TTTV, Cas12f-TTN）。这些蛋白拓宽了用于碱基编辑的原间隔序列邻近基序(PAM)类型范围，并通过使用Cas12允许减小碱基编辑构建体的尺寸（图3A）。此外，通过突变负责PAM识别的BUC叶结构域中的关键氨基酸，可以扩大靶向范围。这种方法已成功用于SpCas9变体，包括SpCas9-NG、SpG和SpRY。然而，BEs更广泛的靶向能力与增加的脱靶率和自我靶向效应相关，需要根据具体的实验目标仔细选择Cas蛋白。
碱基修饰酶的挖掘与改进
BEs依赖于作用于ssDNA的底物碱基特异性修饰酶。这些酶通过脱氨和糖基化选择和修饰靶位点内的碱基，产生被细胞修复系统识别和修复的非天然碱基中间体。此外，这些酶决定了编辑的目标碱基和编辑窗口，通常分别称为序列偏好和编辑活性窗口。优化这些酶（包括脱氨酶和糖基化酶）的主要目标是增强其催化活性并改变其底物碱基识别。
机器学习和图神经网络的进步为蛋白质和DNA语言模型提供了新的见解，实现了数据驱动的合理蛋白质工程。蛋白质组学数据的分类和进化关系，以及蛋白质结构聚类工具（如Foldseek）的发展，增强了蛋白质的挖掘和修饰。这些技术有助于扩展和优化BE工具箱，促进新支架蛋白的发现并提高其效率，从而增强效应蛋白的性能（图3B）。
为了增强脱氨酶性能，Thuronyi等人使用了涉及大鼠来源的rAPOBEC和七鳃鳗同源蛋白PmCDA1的PACE和祖先重建系统。该方法产生了高活性突变体，如evorAPOBEC1、evoFERNY和evoCDA1，显著降低了序列偏好性。Gehrke等人对人胞苷脱氨酶hAPOBEC3A进行了工程化改造，开发了eA3A，在缩小编辑窗口的同时显著减少了BE3的非预期编辑。在单独的研究中，Gaudelli等人和Richter等人分别通过直接进化和PACE优化了TadA7.10，产生了具有显著提高ABE效率的高活性腺嘌呤脱氨酶变体。Yan等人评估了多个TadA变体，并通过组合来自不同变体的突变氨基酸开发了ABE9。Zhang等人通过V28F转化修饰TadA8e-V106W进行了脱氨酶优化。该方法在将转录组脱靶效应降低52倍的同时，提高了靶标编辑效率。此外，TadA来源的胞嘧啶脱氨酶，如CBE6d，与APOBEC1相比，具有更高的编辑效率、更窄的窗口和最小的脱靶效应。
相比之下，大肠杆菌噬菌体辅助蛋白质进化系统的成熟，包括PACE和大肠杆菌正交复制框架，导致了各种碱基编辑工具的创新（图3B）。因此，合理的蛋白质设计是动植物基因工程以及扩展基因编辑工具箱的基础。
为了改善糖基化酶性能，Koblan等人评估了各种尿嘧啶修饰酶以用于CGBE开发，揭示了UdgX在动物细胞中的性能优于UNG。Tong等人对MPG酶进行了结构分析和生化表征，实现了DNA相互作用氨基酸的定向突变和筛选。作者产生了高活性的MPGv3，增强了AYBE的编辑效率和产物纯度。
除了使用人工突变来增强酶活性外，修饰底物识别已成为扩展BEs应用的一种有前景的策略。Liu及其同事通过将腺嘌呤脱氨酶TadA转化为胞嘧啶脱氨酶TadA-CD，开创了这种方法。随后，Yang团队利用错配PCR和细菌筛选改变了糖基化酶UNG和MPG的底物碱基，将其靶标碱基从尿嘧啶和次黄嘌呤扩展到其他嘧啶（C和T）和嘌呤（G）组。这导致了gCBE、gTBE和gGBE的开发。
修复通路的选择
基因编辑工具需要DNA供体，而BEs主要依赖修复通路来产生所需的编辑结果。通过添加相关的蛋白酶来诱导相应的修复通路，可以实现特定的突变。在可用的BE工具中，用于互换任何两个碱基的基本工具已经成熟，满足了研究人员对碱基到碱基转换的要求（图3C）。这一进展是精准基因组编辑的一个重要里程碑。
胞苷脱氨酶将C转化为U，U很容易被UNG识别和切除，从而诱导BER通路并产生indel。添加UGI可抑制UNG活性，从而诱导错配修复并促进C-to-T转换。与CBE不同，抑制内源性烷基腺嘌呤DNA糖基化酶(AAG)并不会增强ABE的编辑效率或编辑产物的纯度，这表明AAG无法有效识别肌苷中间体。该策略消除了额外破坏肌苷损伤修复机制的需要。
相反，增强的MPG活性促进了对I（A脱氨的产物）的识别，产生AP位点。然而，DNA修复方法因物种而异。在玉米中，将ABE与TLS聚合酶融合可通过跨损伤合成促进AP位点修复，产生碱基转换并减少indel副产物的产生。然而，该策略在水稻中应用时未见显著改善。
Koblan等人使用细胞DNA修复相关筛选系统来鉴定提高CGBE效率和纯度的蛋白质，包括POLD2和RBMX。类似地，Chen等人通过加入BER相关蛋白rXRCC1和rPB（分别是DNA聚合酶β的DNA结合结构域和DNA裂解结构域），提高了C-to-G编辑的效率和纯度。
辅助元件的优化
除了底物碱基修饰酶之外，优化编辑系统的其他关键组件（包括核定位信号(NLS)和连接子）仍然至关重要（图3D）。修饰蛋白质的核定位或增加拷贝数可以增强融合蛋白的表达，从而提高编辑效率。Koblan等人用2×双分型NLS替换SV40 NLS，开发了BE4max和ABEmax，实现了改进的编辑性能。
富含GS的柔性连接子是BEs中常用的连接子；它们的长度影响编辑性能。Komor等人报道，BE3中较长的连接子使脱氨酶能够更有效地接触R环内的ssDNA，从而导致均匀的脱氨。相比之下，Xie等人证明将腺嘌呤脱氨酶TadA和Cas9n之间的连接子长度从32个氨基酸减少到16个氨基酸显著提高了DBE ACBE的效率。
改进碱基编辑器的其他通用策略
使用功能元件提高BE效率：与噬菌体Mu Gam蛋白融合可通过保护由AP裂合酶引起的DSB并抑制NHEJ修复来降低indel频率，从而提高CBE产物纯度。Zhang等人将多个人类来源的ssDNA结合域(ssDBD/DBD)与CBE融合。与RAD51 DBD融合增强了CBE编辑活性，从而开发了hyBE4max，用于在动物细胞中进行高效的C-to-T替换。该技术实现了高达80%的编辑效率，并将编辑窗口从C4–C8扩展到C4–C12（指示可有效编辑的原间隔序列中胞嘧啶的位置）。Tan等人通过将RAD51 DBD融合到ABE8e，增强了植物中ABE的效率。此外，Zheng等人研究了DBD融合格式对DBE效率的影响，并开发了PhieDBEs，一套高效植物DBE（图3D）。
使用分裂脱氨酶进行安全编辑(SAFE)以降低脱靶效应：该方法通过将脱氨酶结构域插入nCas9中，将碱基编辑器分裂为其N端和C端部分，从而使脱氨酶和nCas9均失活。最终，该技术阻止了由组成型脱氨酶活性引起的gRNA非依赖性脱靶效应（图3D）。在靶位点，gRNA作为分子支架将分裂的部分重建为功能齐全的碱基编辑器，从而实现靶向编辑。该方法减少了DNA的gRNA依赖性脱靶编辑和CBE诱导的indel突变产生。类似地，He等人通过将eTDG嵌入nCas9的P1249和E1250
