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本综述系统梳理了高通量测序技术在病原体监测领域的最新进展，重点探讨了培养组学（Culturomics）、宏基因组学（mNGS）、宏转录组学（mtNGS）和靶向测序（特别是多重PCR靶向测序）的技术原理、应用场景及挑战。文章特别强调了通过容错性引物设计策略和人工智能（AI）优化，在提升检测灵敏度、特异性及成本效益方面的突破，为构建"一体化健康"（One Health）病原体监测体系提供了关键技术支撑。
引言：新发传染病的挑战与测序技术的机遇
畜牧业和人畜共患传染病给全球经济和公共卫生带来持续威胁，而传统病原体诊断方法存在检测范围有限、耗时长、灵敏度不足等局限。高通量测序技术，尤其是基于多重PCR的靶向测序，以其高灵敏度、高特异性和成本效益，正成为病原体检测领域的变革性工具。本文旨在系统综述各类测序技术在病原体监测中的进展与应用，为可持续发展的一体化健康系统提供支持。
探索培养组学发现新病原体谱系
培养组学通过多种培养条件结合MALDI-TOF质谱或16S rRNA基因测序进行菌种鉴定，能够分离传统方法难以培养的微生物。例如，该技术成功分离出与早产儿坏死性小肠结肠炎相关的产气荚膜梭菌。在动植物研究中，培养组学揭示了肠道微生物多样性及其在健康疾病中的作用，并分离出具有生防潜力的有益微生物。然而，该方法对培养条件要求高且耗时较长，不适用于紧急检测场景。
宏基因组与宏转录组学在病原体检测中的应用
宏基因组测序（mNGS）能够无偏倚地检测临床样本中所有微生物遗传物质，在新生儿肺炎、败血症等复杂感染诊断中表现出色。宏转录组学则通过分析野生动物样本，有效揭示了已知和未知的病原体及人畜共患威胁。在植物领域，通过分析抑病土壤中甜菜根系的宏基因组，可识别与病害抑制相关的微生物群落和功能特征。然而，宿主核酸占比过高是主要挑战，超过99%的测序 reads可能来自宿主，影响低丰度微生物的检测灵敏度。
靶向测序实现微生物鉴定与监测
相较于全基因组测序（WGS），靶向测序（如16S rRNA基因测序）以其快速、经济的特点成为微生物鉴定的有效替代方案。其中，基于多重PCR的靶向测序仅需一两轮PCR即可完成建库，在SARS-CoV-2谱系分析、废水监测及感染源追踪中广泛应用。扩增子测序已成为研究辣椒等作物微生物组的重要工具。但引物选择显著影响物种水平分辨率和检测均匀性，引物二聚体和脱靶效应等问题限制了其检测范围与多重引物兼容性。
多重PCR靶向测序的挑战与引物设计策略
引物设计是多重PCR靶向测序的核心挑战。目前主要存在三种策略：逐条序列设计引物并进行质量评估，过程繁琐；基于K-mer创建的策略能以较少引物实现高靶标覆盖；通过多序列比对设计简并引物则能简化设计流程并扩大覆盖范围。然而，多数方法仅基于引物与模板的完全匹配，未能充分利用容错潜力。
容错策略：提升PCR靶向测序性能
研究表明，即使存在碱基错配，只要匹配碱基的热力学稳定性超过错配碱基，PCR仍可启动。因此，允许特定数量错配（X errors）的容错性引物设计可显著提高覆盖率。例如，在允许一个错配的情况下，仅需两个简并度为4的引物即可实现100%覆盖，同时避免将简并碱基和错配置于引物3′末端，可减少二聚体形成并维持特异性。容错性引物设计是一个NP完全问题，现有工具如HYDEN、Primux和MultiPrime各具特色，但针对错配位置、类型对引物效率影响的系统优化仍显不足。
人工智能在测序技术中的革命性作用
人工智能（AI）正驱动组学技术和靶向测序的革新。在临床诊断中，AI算法可增强mNGS从高宿主背景中识别微生物信号的能力，提高低丰度病原体和混合感染的检测灵敏度。在兽医领域，AI优化的纳米孔测序可用于快速检测非洲猪瘟病毒等重大动物病原体及监测耐药基因。在农业方面，AI支持的16S rDNA测序能特异性检测观赏植物中的低丰度微生物，并预测大麦网斑病等作物病害的发生。AI在容错性引物设计、宿主DNA去除以及便携式测序平台实时诊断等方面的创新，正推动病原体监测向精准化、现场化发展。
结论：技术整合与未来展望
任何单一技术均非万能解决方案：培养组学精度高但无法检测不可培养物种；宏基因组学全面但成本高、分析复杂；靶向测序针对已知靶标灵敏经济却无法发现新病原体。因此，需根据具体检测目标（已知或新型病原体）和宿主系统（人、动物、植物）选择并整合适当策略。未来需重点解决生物信息学数据分析的标准化问题，降低误诊风险，并发展可解释人工智能（XAI），结合生物学网络等领域知识优化引物设计、提升检测准确性，最终实现测序技术在临床、兽医和农业领域的广泛应用，为全球健康韧性和可持续发展提供保障。
