《Analytical Chemistry》：Optical Extraction of Single Microplastics Followed by Online Molecular and Elemental Characterization
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本文创新性地将光流控力诱导（OF2i）、单颗粒拉曼光谱（SP Raman）与单颗粒电感耦合等离子体质谱（SP ICP-MS）在线联用，构建了首个三模态分析平台。该平台通过光学捕获实现微塑料（MPs）的精准提取与基质置换，有效降低了SP ICP-MS的碳背景干扰，显著提升了小尺寸微塑料（低至1.0 μm，0.6 pg C/颗粒）的检测能力，并为复杂环境基质（如土壤）中微塑料的聚合物类型识别（如PS、PA-6）提供了单颗粒水平的分子证据，为环境污染物分析提供了强有力的新技术。
引言
微塑料（MPs）已成为普遍存在的环境污染物，在陆地和水生系统中无处不在。它们通常被定义为尺寸小于5毫米的固体聚合物颗粒，可能对生态系统和健康产生影响，这激发了对追踪和彻底表征这些颗粒的专用方法的开发需求。然而，微塑料具有不同的聚合物类型、广泛的尺寸分布，并且存在于复杂的环境或生物基质中，与大量天然胶体结构共存。目前存在显著的分析空白，需要提供高选择性和灵敏度的适当技术和方法。许多已建立的方法只能进行整体分析，无法获取单颗粒信息，和/或无法以足够快的速度计数环境/生物浓度下的小微塑料，以获得关于不同聚合物物种的统计学有意义的数据。例如，动态光散射等方法无法提供足够的选择性来区分微塑料和天然胶体，也不能识别不同的聚合物类型。电子显微镜等视觉分析技术能够分析单个颗粒，但不适用于在自然水平上精确定位微塑料、识别其聚合物类型以及在天然基质中检测它们。然而，傅里叶变换红外光谱（FTIR）和拉曼显微镜可能适用于鉴定分离出的微塑料的聚合物种类，但可能耗时且计数复杂基质中足够数量颗粒的能力有限，尤其是在低颗粒数浓度（PNCs）和较小直径的情况下。
分析微塑料的一个相对较新的方法是电感耦合等离子体质谱（ICP-MS），该技术可以在“单颗粒”（SP）模式下运行以逐个检测颗粒。ICP-MS仪器可以配备不同的质量分析器：四极杆（ICP-QMS）在单颗粒模式下对单一选定的质荷比（m/z）具有高灵敏度，而飞行时间（ICP-TOFMS）分析器可以分析颗粒中几乎所有的元素，并进一步实现非目标颗粒筛选。当以碳（C）为目标时，ICP-TOFMS和ICP-QMS都适用于分析复杂基质中的单个微塑料。然而，值得注意的是，微塑料中包含的所有物种/分子信息（例如聚合物类型）在ICP的剧烈原子化和电离过程中都会丢失。因此，无法区分特定的颗粒状碳物种，并且分析含有例如不同微塑料、颗粒有机物、细胞、细菌和/或黑碳的样品非常有限。此外，微塑料SP分析的检测限受到溶解物种产生的碳背景的限制。在高背景条件下，检测限因此增加。最后，当分析微米级颗粒时，表征重要的单颗粒参数（如颗粒传输效率）变得越来越困难，并且在评估颗粒数浓度和尺寸分布时，大颗粒似乎被低估了。
当引入和联用互补技术时，推进微塑料分析是可能的，这些技术可以解读聚合物身份，同时提供研究尺寸和数量的补充途径。这些互补技术必须与SP ICP-MS兼容，并提供非破坏性表征能力，以在颗粒被ICP消灭之前研究它们。在最近的一项研究中，我们证明了将二维光学陷阱与SP ICP-MS耦合的可能性。这允许对无机颗粒和微塑料进行高级表征。在该研究中，使用光流控力诱导（OF2i）的二维陷阱以一种新模式使用，该模式能够在弱聚焦涡旋激光束中静态捕获颗粒。OF2i与SP Raman模块的联用使得能够在单微塑料分辨率下识别聚合物类型。光学陷阱和质谱技术的联用具有通过结合其优势并避免其一些局限性来推进微塑料分析的高潜力。
在本研究中，我们从先前证明的双重耦合推进到首个在线三模态平台的功能实现，该平台统一了OF2i、SP Raman和SP ICP-MS。新开发的原型能够在单一分析工作流程中实现光学捕获、分子识别和元素分析。使用OF2i静态捕获模式，我们采用光学提取机制从复杂基质中分离悬浮颗粒，从而降低背景并实现物种特异性分析。超越模型标准品，我们展示了所开发的平台如何应对现实的分析挑战，绕过胶体和溶解干扰，并表征复杂环境基质中的工业初级微塑料原料聚合物。
材料与方法
耗材与样品制备
聚苯乙烯（PS）标准品（5 μm）购自Sigma-Aldrich。聚酰胺-6（PA-6）由巴斯夫（BASF SE）提供（Dx50 = 7.5 μm）。碳酸钠（Na2CO3）购自Carl Roth，用于创建1 g/L溶解碳标准品。在第一个概念验证中，用PS微塑料加标到此标准品中。100 nm金纳米球购自NanoComposix，离子金标准品由商业单元素ICP-MS标准品在纯水中稀释而成。超纯水来自Merck Millipore系统，用于稀释和清洗步骤。使用50 mL聚丙烯小瓶进行稀释和储存。通过OF2i和SP ICP-MS制备和分析空白样来研究这些小瓶的微塑料背景，未发现微塑料。
土壤样品的制备遵循Pfohl等人开发的提取方案。将2克高压灭菌的土壤（Lufa 2.2）用75 mg PA-6加标。为了提高微塑料和土壤颗粒的分散性和解聚性，添加了一滴表面活性剂Lutensol TO7。微塑料的回收率约为70%，有关提取方法的更多细节可在相应方案中找到。未加标PA-6的空白土壤样品也进行了平行处理。
仪器
使用Brave B-Curious OF2i仪器，该仪器采用圆柱形微流体流动通道（1.3 mm），并配备最大功率为2 W的532 nm连续波二极管泵浦固体状态（CW DPSS）激光器（Laser Quantum, GEM532）。使用两个反射镜和一个5倍光束扩展器进行光束对准。使用零级涡旋半波板（q = 1）产生拓扑荷m = 2的角向偏振拉盖尔-高斯激光模式，并在流动池内聚焦。颗粒散射的光被放大并通过超显微镜设置记录。使用棱镜分辨单个颗粒的拉曼信号，并在90度角使用CMOS相机记录。通过使用内部校准方法将频率偏移校准为波数，其中来自水性介质的水的拉曼信号用作锚点。将检测到的微塑料光谱与常见聚合物的参考光谱进行比较。虽然微塑料的拉曼信号与参考光谱之间存在高度相关性，但不同谱带的强度存在明显差异。这些差异是由于所应用激光的波长明显低于已建立拉曼光谱仪和用于记录参考光谱的波长所致。
使用安捷伦7900系列（Agilent Technologies）ICP-MS仪器在SP模式下运行，采用0.1 ms的驻留时间，并采集2分钟间隔的12C信号。根据先前研究的讨论，使用H2作为反应/碰撞气体，流速在2至3 mL/min之间。使用全消耗雾化器和雾化室（CytoNeb, CytoSpray, Elemental Scientific）以提高气溶胶传输效率，通过分析100 nm金纳米球和10 ng/g金标准品，同时使用蠕动泵维持8 μL/min的流速，确定传输效率在60%至80%之间。在耦合OF2i、SP拉曼光谱和SP ICP-MS时使用相同的流速。
数据分析
OF2i仪器使用HANS软件（Brave Analytics）操作，并以200 fps记录实时视频流。SP拉曼数据以7.7 fps记录，并使用内部开发的MATLAB例程进行分析。
SP ICP-MS数据使用MassHunter（Agilent Technologies）记录，并保存为.csv文件。随后，使用SPCal进行进一步的数据处理。对于检测到的微塑料事件的质量和尺寸计算，使用先前分析的5 μm PS标准品的平均质量响应来校准12C信号。使用迭代阈值算法，该算法基于初步阈值移除SP信号以找到背景信号的平均值。重复此过程直到不再发现颗粒事件。在高平均值（>10计数）时，使用高斯统计（5σ），否则使用泊松统计（α = 10–8）。找到的SP信号在平均信号值以上累积，并将得到的峰面积数据阵列导出，以便通过OriginPro（OriginLab 8.5）进行后续图形分析。
结果与讨论
OF2i、SP Raman和SP ICP-MS的联用
在之前的概念验证中，我们提出了一种新的联用技术，该技术将SP ICP-TOFMS与OF2i结合，以在ICP原子化之前捕获和光学表征颗粒。我们进一步证明了OF2i可以与SP Raman模块耦合，获得化学选择性以在单颗粒分辨率下识别微塑料类型。在本研究中，我们在先前设置的基础上推进，并将所有三种技术在线联用。这种结合带来了某些优势，同时消除了一些局限性。由此产生的结合OF2i、SP Raman和SP ICP-MS的三模态平台为在复杂环境中操纵和表征微塑料提供了新的分析途径。光学陷阱使用激光涡旋光束，通过OF2i根据其尺寸和折射率捕获多个颗粒。与高斯光束设置相比，在二维光学陷阱中利用光学和流体力提供了关键优势。多个颗粒可以按尺寸和折射率定向的顺序被静态捕获。此外，涡旋光束呈现“甜甜圈”形状，允许捕获相同尺寸和折射率范围内的颗粒彼此相邻，同时最大限度地减少陷阱内的颗粒间相互作用。
SP Raman分析静态捕获的颗粒。颗粒的静态捕获允许连续记录光谱，以提高信噪比并降低检测限。单个颗粒的拉曼信号取决于尺寸和折射率。因此，检测小颗粒的能力受到聚合物类型以及来自周围介质（本例中为水性介质）的显著拉曼信号干扰的影响。对于本研究中分析的微塑料物种，基于拉曼的尺寸检测限估计在600至800纳米之间。然而，值得注意的是，拉曼光谱仅考虑非弹性散射光部分，其强度明显低于弹性散射部分（瑞利散射）。当聚焦于后者时，无法获得物种信息，但可以分析更小颗粒的位置，如图所示。这里展示了尺寸在100至800纳米之间的PS标准颗粒，并按照先前研究中的演示进行了尺寸校准。颗粒在陷阱中的横向位置取决于颗粒的折射率和尺寸。因此，对于已知的颗粒状聚合物，当考虑光学力（米氏理论）和阻力时，可以校准尺寸。
OF2i-Raman与SP ICP-MS的联合是通过使用全消耗雾化器和雾化室设置实现的，该设置在低样品流速下提供高传输效率。对于本研究而言，这在从OF2i-Raman释放和转移颗粒到SP ICP-MS仪器时，对于最大化SP ICP-MS中可检测颗粒的数量是实用的。上部尺寸检测限受较大颗粒传输效率降低的限制，估计约为10-15 μm，这与Fazzolari等人最近的一项研究一致。因此，SP ICP-MS只能考虑一部分微塑料，并且校准的尺寸仅指“可检测的”微塑料，同时假设为球形几何形状。虽然后者对于PS微塑料标准品是准确的，但不能假设用于次级和老化微塑料，因此，可检测颗粒的尺寸直方图是尝试性的。然而，本研究的重点是开发一种光学提取机制，以分离颗粒，识别其聚合物骨架，并交换基质以改善SP ICP-MS中的检测限。总之，这实现了如下一节所示的在线分子和元素表征。
微塑料的光学提取
在SP ICP-MS中，瞬态数据包括元素溶解部分的贡献（表现为升高的背景）和单颗粒事件的贡献（表现为持续时间通常为400-800 μs的短信号尖峰）。背景显示出一定水平的噪声，可以根据平均值用高斯或泊松统计建模。随着平均信号水平的增加，绝对噪声水平也会增加，并且小颗粒的信号可以以较低的可信度确定。特别是对于常见元素，溶解背景信号可能很高，并显著降低检测限。对于微塑料，干扰以及高水平的溶解碳物种使单事件检测复杂化，并显著减小可分析尺寸窗口。这对于分析环境基质中的小微塑料是一个严重的限制，因为环境基质可能含有具有各种溶解碳物种的复杂成分。
在此，我们建议使用光学陷阱将微塑料从其初始基质中分离出来，并用超纯水交换介质。这不仅改善了SP ICP-MS中的尺寸检测限，而且降低了基质负担，从而减少了等离子体中的基质效应。将PS微塑料（5 μm）加标到含有1 g/L溶解碳（以Na2CO3形式）的溶液中。随后，将样品引入光学陷阱，并如前所述（例如图中所示）静态捕获PS颗粒。最大捕获容量约为30-50个颗粒，当接近该值时，用超纯水交换碳酸盐基质。SP ICP-MS与光学陷阱在线耦合，瞬态SP数据集如图所示。此处，迹线（a）显示了高碳酸盐基质下的分析结果，可以看到较大微塑料部分的一些SP信号。在起始条件下，下部尺寸和质量检测限确定为3.2 μm和18 pg碳/颗粒，如图所示。在提取过程（迹线（b））中，碳酸盐基质被超纯水取代，降低了碳的背景信号。在基质置换步骤中，颗粒被保留在陷阱中，并且在初始冲洗期后，在SP ICP-MS中未检测到进一步的微塑料事件。迹线（c）显示了基质交换过程开始后40分钟时的溶解背景，表明基线低且稳定，这导致尺寸和质量检测限为1.0 μm和0.6 pg碳/颗粒。在此概念验证期间，尺寸和质量限的改善因子分别为3.1和28。随后，释放提取的颗粒（迹线（d））用于具有增强检测限的SP ICP-MS分析。先前捕获的微塑料在大约2分钟内被检测到。值得注意的是，交换过程、转移和通过SP ICP-MS回收微塑料需要几分钟，这可能与OF2i和SP ICP-MS之间的颗粒传输效率低下、需要以低流速运行SP ICP-MS以保持一致的传输效率，以及存在死体积和湍流源的多个连接有关。在未来的研究中，可能通过专用的微流体设置来改善传输时间并减少微塑料扩散。这将转化为在短间隔内多次循环捕获和释放实验的可能性，以提高颗粒计数率。
由于OF2i不仅与SP ICP-MS耦合，还与SP Raman模块耦合，因此还可以在捕获和提取过程中获取聚合物信息。在环境场景中，微塑料聚合物通常未知，识别能力提供了关键优势。一方面，了解微塑料类型对于理解环境和/或健康影响很重要。另一方面，它对于推导质量分数和密度是相关的，这两个参数是估算SP ICP-MS中颗粒质量和尺寸所必需的。
PS标准品的光学提取重复了几次，直到在SP ICP-MS中计数至少60个颗粒以估计可检测颗粒的尺寸分布。图A显示了由此产生的尺寸直方图，旁边是一个代表性的单颗粒PS拉曼光谱。在同一图中，显示了PS的参考光谱（灰色），证明了在没有先验知识的情况下识别微塑料的能力。
加标和提取土壤中微塑料的分析
继第一个使用PS标准品的概念验证之后，分析了用不规则PA微塑料加标的土壤样品，作为第二个概念验证，模拟了一个更偏向环境的场景，其中微塑料表现出更大的多分散性以及一系列不同的形状。在样品制备过程中，使用Pfohl等人的再悬浮和密度分离方案回收微塑料。这产生了也含有其他胶体物质的悬浮液，并呈现了大多数环境样品的预期场景，其中微塑料仅占整个颗粒物质的一小部分（基于数量）。对于这些环境场景，精确定位和表征单个微塑料具有挑战性。将此悬浮液稀释（1:10）后，PA-6微塑料被光学捕获，而其他（较小的）胶体物质被丢弃。在这种情况下，仅捕获了PA-6微塑料，这有助于通过SP ICP-MS进行进一步分析。在其他颗粒与微塑料一起捕获的情况下，OF2i-SP Raman表征仍然是可能的，但在SP ICP-MS中回收不同的颗粒物种具有挑战性。图A显示了拉曼通道，其中可以看到四个被捕获的PA-6微塑料的信号。水的拉曼信号位于3000 cm–1以上、1640 cm–1附近和250 cm–1以下，这对于波数的内部校准很有用。水平维度表示颗粒在光学陷阱中的横向位置，底部的强烈散射信号是来自微塑料的瑞利散射。由被捕获PA-6微塑料的非弹性散射引起的频率偏移沿垂直轴可见（例如，黄色区域）。在激光焦点（红色虚线）后面的区域（图A中的青绿色区域），无法静态捕获微塑料，拉曼信号仅由水性介质引起。记录该区域是为了研究基质交换过程中的基质组成，并在基质交换过程中的三个不同时间点记录的光谱如图所示。950 cm–1处的信号由基质引起，并被监测作为基质何时被交换的指标，这发生在大约10分钟后。此时，降低激光功率以从陷阱中释放光学提取的颗粒。图C显示了一个被捕获颗粒的校准后拉曼通道，1100至1650 cm–1之间的明显拉曼信号用于将微塑料聚合物识别为PA-6。光学提取后，仅观察到PA-6拉曼信号，未保留其他碳颗粒。相应地制备未加标的土壤作为空白，未检测到微塑料。随后回收颗粒并通过SP ICP-MS进行分析，并重复针对PS解释的捕获、提取和释放程序，以通过SP ICP-MS估计尺寸分布，如图所示。可检测的PA-6微塑料的平均尺寸为2.6 μm，尺寸检测限确定为1.2 μm。
结论
微塑料的分析对分析技术提出了挑战，因为它们需要解决各种化学和物理方面的问题，例如复杂基质中颗粒的化学组成和尺寸。单颗粒技术正在占据重要地位，以解决颗粒的异质性，并描述颗粒的内部和外部混合状态，同时计数和表征微塑料。然而，当前的单颗粒技术本身仅提供对复杂颗粒的有限访问，当结合不同的单颗粒检测范式时，可以获得新的视角。在本研究中，首次开发了一个由OF2i、SP Raman和SP ICP-MS组成的单颗粒三模态联用平台，用于实现对单个微塑料的多模态分析。重点在于测试光学提取的概念，该概念能够实现微塑料的分离、操纵和表征。如两个概念验证所示，这种光学提取减轻了基质效应，实现了微塑料识别，并提高了SP ICP-MS中对微塑料的检测限。
虽然可以捕获、释放和通过SP ICP-MS回收成批的颗粒，但无法在OF2i-Raman和SP ICP-MS之间追踪相同的颗粒。这些局限性可能会在存在多于一种微塑料聚合物或其他碳颗粒时使分析复杂化，因为当它们到达ICP时，其捕获顺序不被保留。因此，尚无法获得关于同一颗粒的化学和元素信息。然而，在未来，使用更高效的微流体传输系统以及例如光学色谱设置（逐渐降低激光功率以逐个释放单个颗粒）可能使这成为可能。此外，米氏理论可在未来用于提供尺寸分布的补充见解，并且OF2i可用于计数微塑料并确定数浓度。这不仅为颗粒尺寸的内在验证提供了机会，而且为扩展可分析尺寸窗口和改进颗粒数校准提供了机会。
总体而言，本研究超越了早期的双重耦合可行性测试，交付了首个可操作的在线OF2i–SP Raman–SP ICP-MS平台。该系统在一个工作流程中结合了光学捕获、化学表征和元素分析，并为颗粒的新提取方法提供了机会。这使得能够针对环境相关基质中的相关工业微塑料颗粒。然而，值得注意的是，OF2i–SP Raman–SP ICP-MS并不局限于微塑料的分析，还可能进一步应用于分析一系列纳米和低微米尺度的无机（例如，矿物）颗粒，为获得相关矿物基颗粒的新视角提供了有前景的机会。
