基于多重同位素反应监测的样品内校准技术：复杂大麻产品中THC和THCA的基质耐受性定量分析新策略

《Journal of the American Society for Mass Spectrometry》：Matrix-Tolerant Quantification of THC and THCA in Complex Cannabis Products Using In-Sample Calibration with Multiple Isotopologue Reaction Monitoring

本文开发了一种基于稳定同位素标记（SIL）分析物的多重同位素反应监测（MIRM）样品内校准曲线（ISCC）方法，实现了Δ9-四氢大麻酚（THC）和Δ9-四氢大麻酚酸（THCA）在复杂大麻衍生产品中的精准定量。该方法通过理论同位素丰度生成内部校准点，克服了传统LC-MS（液相色谱-质谱联用）工作流中基质效应显著、浓度范围宽泛的难题，在线性度（R2> 0.999）、精密度（RSD <10%）和准确度（±10%）方面均表现优异，为法医和常规大麻素分析提供了高效实用的校准策略。

　　

引言

随着大麻和大麻衍生消费品的日益普及，准确可靠地定量分析各类产品基质中的Δ⁹-四氢大麻酚（THC）、Δ⁹-四氢大麻酚酸（THCA）及相关大麻素变得至关重要。美国2018年农业改进法案等监管框架将工业大麻 legally 定义为总THC（Δ⁹-THC与Δ⁹-THCA之和）含量低于0.3%的品种，这使得定量化学分析对于区分合规工业大麻产品与受管制的大麻材料至关重要。因此，法医实验室越来越需要对化学多样性高、通常极为复杂的基质（如植物材料、食品、油剂、膏体、蜡质和膳食补充剂）进行高通量大麻素测试。这些基质常常引入显著的基质效应，包括离子抑制和非线性检测器响应，对传统的基于LC-MS的定量工作流程构成了重大挑战。

材料与方法

本研究采用LC-MS级乙腈（ACN）、甲醇、甲酸和HPLC级水。Δ⁹-THC、Δ⁹-THCA及其稳定同位素标记物（THC-D₃, THC-D₉, THCA-D₃）均购自标准品公司。样品材料包括从当地零售商获得的樱桃工业大麻、CBD软糖、CBD胶囊（油剂）、CBD唇部和身体香脂（蜡质）、CBD乳霜以及CBD膳食补充剂，以及两个来自俄亥俄大学分析/法医化学实验室的遗留植物材料（经验证总THC均<0.3%）。

样品前处理根据基质特性采用不同方案：植物材料用甲醇提取；软糖采用QuEChERS（快速、简便、廉价、高效、可靠、安全）方法水-乙腈提取；油、蜡、乳霜等脂肪丰富样品则增加了己烷脱脂步骤。所有提取液均经过滤后进行分析。

仪器分析使用岛津LCMS-8050三重四极杆质谱系统，配备双独特电离源（DUIS），THC及其同位素标记物在正离子模式下检测，THCA及其标记物在负离子模式下检测。色谱采用UPLC BEH shield RP18柱，梯度洗脱。关键创新在于应用了多重同位素反应监测（MIRM） transitions。

理论与构建样品内校准曲线（ISCC）

ISCC定量策略基于稳定同位素标记（SIL）分析物可预测的同位素分布以及通过MIRM transitions监测这些分布的能力。以THC-D₃为例，其单同位素前体离子为m/z 318.3，主要碎片离子为m/z 196.1。自然同位素取代（如¹³C, ²H）产生了一系列同位素变体，从而形成一组额外的MIRM通道（如m/z 318.3→196.1, 319.3→196.1, 319.3→197.1等）。每个transitions的理论相对同位素丰度可通过中性丢失碎片和产物离子同位素变体的相对丰度乘积计算得出。实验测量值与理论值高度一致（R²= 1.000），验证了理论模型可靠性。

研究中为THC特意加入了两种SIL类似物（THC-D₃和THC-D₉），并添加在不同水平，以扩展可用校准范围。这是因为实际样品中THC浓度变化范围极广。将验证后的理论相对丰度转换为“理论浓度当量”，作为构建ISCC的x值。由于标记与未标记分析物在相同摩尔浓度下可能存在响应差异，研究引入了经验性校正因子（α）进行 harmonize。应用校正因子后，THC-D₃和THC-D₉的MIRM transitions汇聚到一条校准线上，为THC提供了约690倍的动态范围。未标记的THC自身同位素变体transitions计算出的浓度也落在同一条回归线上，表明即使单同位素transition饱和，其较低丰度的同位素变体通道仍可用于准确定量，无需额外稀释。THCA-D₃的transitions则产生了约370倍的动态范围，结果类似。

大麻衍生产品中的基质效应

在六种代表性样品类型（植物、软糖、油、蜡、乳霜、膳食补充剂）中评估了基质效应，通过比较SIL内标（THC-D₃, THC-D₉, THCA-D₃）在各基质中相对于溶剂对照的响应。所有基质均产生了不同程度的离子抑制，其中软糖的抑制效应最强（THC-D₃, THC-D₉, THCA-D₃的信号分别为溶剂信号的58%, 59%, 38%）。尽管存在基质依赖性的强度差异，但由SIL内标构建的ISCC在每种基质中均保持了优异的线性（R²> 0.999）。虽然斜率因离子抑制程度不同而异，但理论浓度当量与测量峰面积之间的线性相关性得以保留。由于同位素丰度在均匀抑制下成比例缩放，斜率变化不会影响定量。这表明ISCC方法通过在校品内部生成校准曲线，固有地补偿了基质效应。

ISCC定量的精密度与准确度

在CBD油和CBD软糖两种代表性基质中，使用三个加标水平（0.030%, 0.10%, 0.30%）评估了ISCC方法的精密度和准确度。结果显示，由单同位素MIRM transitions计算出的浓度在所有水平上都与加标值紧密匹配，精密度（% RSD）始终低于10%。准确度（以与真实浓度的百分比偏差表示）在两种基质中对两种分析物均保持在±10%以内。使用THC和THCA的次要MIRM transitions也获得了令人满意的性能（准确度在±15%以内，精密度≤15%）。这凸显了在浓度超过主要transition上限或单同位素transition受到意外基质干扰时，使用天然同位素变体通道进行准确定量的效用。

ISCC在商业基质中的定量应用

在一系列商业CBD产品（油、蜡、乳霜、软糖、膳食补充剂）和两种大麻衍生植物材料中评估了ISCC策略的适用性。将ISCC方法测得的THC和THCA浓度与常规外标法测得的结果进行比较。在所有基质中，ISCC推导出的浓度与1:1一致性线高度吻合，在低浓度（0.005–0.025%）和高浓度（0.025–0.625%）范围内均表现出极好的一致性。这种一致性即使在已知会引起显著离子抑制的基质（如软糖、乳霜、蜡质）中也得以保持，表明ISCC方法通过直接在每份样品中构建校准曲线，成功补偿了基质依赖性变异。

结论

本研究开发了一种基于多重同位素反应监测（MIRM）的样品内校准曲线（ISCC）策略，用于大麻衍生产品中THC和THCA的定量。通过利用稳定同位素标记（SIL）校准物的理论相对同位素丰度，ISCC方法在每次进样中生成多个内部校准点，消除了对外部校准曲线和基质匹配标准品的需求。为THC加入两种SIL校准物（THC-D₃和THC-D₉），并结合校正因子程序以协调标记与未标记分析物之间的响应差异，实现了超过600倍动态范围的定量，应对了实际样品中遇到的极端浓度变异。ISCC方法在多种基质（包括植物材料、食品、油剂、蜡质、乳霜和膳食补充剂）中表现出优异的线性、精密度和准确度。基质效应评估表明，内部生成的校准曲线有效补偿了离子抑制和信号变异，即使在高复杂度产品基质中也产生一致的结果。与常规外标法的比较证实了在所有浓度水平和样品类型上均具有高度一致性，突显了ISCC工作流程的稳健性和可靠性。

ISCC是一种校准策略而非分离机制；因此，区分Δ⁹-THC与其他位置异构体（如Δ⁸-THC和Δ¹⁰-THC）取决于色谱分离度。只要采用足够的LC分离（即美国国家标准与技术研究院的HPLC方法）和适当的同位素标记标准品，ISCC工作流程可以扩展至Δ⁸-THC和Δ¹⁰-THC的定量。

总之，这项工作将ISCC–MIRM概念扩展至法医和消费品领域，并为常规大麻素分析建立了一种实用、高效且耐受基质的校准策略。该方法显著减轻了分析负担，提高了对基质异质性的耐受性，并为负责大麻和工业大麻产品监管和法医测试的实验室提供了传统校准工作流程的有吸引力的替代方案。