基于蛋白质组学揭示疏果苹果多酚通过调控铁死亡和氧化应激通路缓解DNBS诱导的小鼠结肠炎机制

《Journal of Proteome Research》：Proteomics-Driven Mechanistic Insights into the Anti-Inflammatory Potential of Thinned Apple Polyphenols in a DNBS-Induced Colitis Model in Mice

本研究通过蛋白质组学分析首次系统阐明疏果苹果多酚（TAP）在DNBS诱导结肠炎模型中的多靶点作用机制。研究发现TAP能显著激活抗氧化防御系统（Nrf2/ARE通路），逆转铁死亡（ferroptosis）和血红素毒性相关蛋白表达，并抑制NF-κB介导的炎症级联反应。该研究为开发基于农业副产物的天然抗炎制剂提供了理论依据，兼具药理创新性和资源可持续性价值。

　　

引言

溃疡性结肠炎（UC）作为一种慢性炎症性肠病（IBD），其全球发病率持续上升，现有治疗方案如氨基水杨酸制剂和皮质类固醇虽能缓解症状，但存在明显副作用。生物制剂虽疗效显著，却受限于高昂成本和严格适用标准。因此，开发兼具疗效和安全性的新型治疗策略成为当务之急。氧化应激和炎症反应在UC病理进程中扮演关键角色，这使得具有抗氧化和抗炎活性的天然化合物成为研究热点。疏果苹果（TA）作为苹果生产链中的副产物，其多酚含量可达成熟苹果的10倍以上，前期细胞实验已证实疏果苹果多酚提取物（TAP）具有显著的抗炎和抗氧化潜力。

材料与方法

动物模型与实验设计

采用雄性CD1小鼠建立DNBS诱导的结肠炎模型，通过直肠灌注DNBS（4mg/100μL 50%乙醇）诱发炎症。实验分为四组：假手术组（SHAM）、假手术+TAP组（SHAM_TAP）、DNBS模型组（DNBS）和DNBS+TAP治疗组（DNBS_TAP）。TAP以10mg/kg剂量每日灌胃给药，持续4天。通过结肠宏观损伤评分、组织学检查（H&E染色）和髓过氧化物酶（MPO）活性测定评估炎症程度。

蛋白质组学分析

采用Label-Free定量蛋白质组学技术（LFQ）对结肠组织进行分析。组织样本经含SDS的裂解液匀浆后，通过S-Trap柱进行胰酶消化。肽段经nano-LC分离后，在Orbitrap Fusion Tribrid质谱仪中进行数据依赖采集（DDA）。原始数据通过MaxQuant软件（v.1.6.0）处理，以UniProt小鼠数据库为参考，设置假发现率（FDR）<1%。差异表达蛋白筛选标准为log₂FC>0.50或<-0.50且q<0.05。通路富集分析使用STRING和IPA（Ingenuity Pathway Analysis）软件完成。

结果与讨论

TAP改善结肠炎病理特征

DNBS处理导致结肠黏膜充血、溃疡形成和体重显著下降（p<0.001），而TAP治疗组上述指标明显改善。组织学分析显示DNBS组出现广泛坏死、水肿和白细胞浸润，TAP治疗显著减轻这些病理改变（p<0.01）。MPO活性测定证实TAP能有效抑制中性粒细胞浸润（p<0.001），表明其具有强大的抗炎作用。

蛋白质组学揭示DNBS诱导的分子通路紊乱

对比DNBS与SHAM组，5451个鉴定蛋白中有362个显著差异表达。STRING分析显示DNBS激活了多个关键通路：

1. 1.
   免疫系统激活：整合素结合通路（强度0.79，FDR=0.0012）显著富集，促进白细胞上皮迁移。IPA预测巨噬细胞活化（Z-SCORE=2.499），伴随TNF-α、IL-23等炎性因子上调。
2. 2.
   氧化应激反应：髓过氧化物酶（MPO）、钙卫蛋白（S100A8/S100A9）显著上调，激活NADPH氧化酶产生ROS。同时抗氧化防御通路如过氧化氢分解过程（强度2.64，FDR=8.5×10^-5）和谷胱甘肽代谢通路（GPX3、MGST1、GGT5）被激活。
3. 3.
   血红素毒性机制：血红蛋白亚基（HBB1、HBB2、HBA）和结合蛋白（HPX、HP）显著升高（log₂FC=1.35-8.05），提示结肠出血导致血红素介导的毒性反应。
4. 4.
   铁死亡激活：转铁蛋白（TRF）、铜蓝蛋白（CP）和长链脂酰辅酶A合成酶（ACSL3/4）上调，表明铁依赖的脂质过氧化细胞死亡通路被激活。
5. 5.
   伤口愈合反应：凝血因子和血管生成相关蛋白（纤维蛋白原、血栓收缩蛋白等）上调，促进组织修复。
6. 6.
   黏液层变薄：黏蛋白MUC2表达下降（log₂FC=-0.99），削弱肠道屏障功能。

TAP逆转炎症通路的分子机制

DNBS_TAP与DNBS比较显示，TAP治疗能显著逆转上述异常通路：

1. 1.
   炎症抑制：急性期反应信号通路被显著抑制（Z-SCORE=-2.00），NF-κB和IL-6活性降低。诱导型一氧化氮合酶（NOS2）表达下降（Z-SCORE=-2.52），减少活性氮物种（RNS）生成。
2. 2.
   氧化应激调控：TAP激活Nrf2介导的抗氧化反应，上调超氧化物歧化酶（SOD1/SOD3）、谷胱甘肽过氧化物酶1（GPX1）、NAD(P)H醌氧化还原酶1（NQO1）和过氧化还原蛋白6（PRDX6）。值得注意的是，SOD3在DNBS组已激活（Nrf2依赖），而TAP进一步强化该通路，同时激活SOD1等Nrf2非依赖途径。
3. 3.
   血红素毒性缓解：HP、HPX和血红蛋白亚基水平接近生理状态，表明TAP减轻结肠出血和后续毒性反应。
4. 4.
   伤口愈合正常化：凝血和血管生成相关蛋白表达回落，反映组织损伤减轻。

ELISA验证

选择触珠蛋白（HP）和铜蓝蛋白（CP）进行ELISA验证，结果显示DNBS组HP浓度升至1.0169μg/mL（SHAM组未检出），CP升至189.2043μg/mL（SHAM组153.2310μg/mL）。TAP治疗使HP降至0.3087μg/mL，CP降至136.1409μg/mL，与蛋白质组学数据高度一致。

结论

本研究通过整合病理学评估和蛋白质组学分析，系统阐明了TAP通过多靶点作用缓解结肠炎的机制：一方面激活Nrf2介导的抗氧化防御体系，另一方面抑制NF-κB驱动的炎症级联反应。特别值得注意的是，TAP能特异性逆转铁死亡和血红素毒性通路，这为天然多酚化合物的药理作用提供了新视角。此外，将农业副产物转化为高附加值健康产品的策略，既符合循环经济理念，又为IBD治疗提供了安全有效的新型候选物质。