《Bioorganic Chemistry》：Tunable triazole-based cholera toxin inhibitors: A QSAR-guided design and evaluation approach
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本研究通过整合计算化学与实验方法，开发了具有低微摩尔活性和高合成可及性的三唑类霍乱毒素B亚基（CTB）抑制剂。基于QSAR建模筛选出44个化合物，其中5d的IC50为11.78±1.2 μM，计算验证了其与CTB的适配性及抑制活性，为设计高效多价抑制剂奠定了基础。
Huma Basheer|Chandra S. Azad|M. Samim|Imran A. Khan
印度新德里Jamia Hamdard大学化学与生命科学学院化学系有机合成实验室，邮编110062
摘要
霍乱毒素B亚单位（CTB）是抗霍乱治疗的验证目标，但目前的抑制剂通常存在合成复杂性高和可调性有限的问题。本研究旨在开发一种紧凑、可调的三唑骨架，该骨架具有低微摩尔级的抑制活性，并且易于合成。我们采用了一种统一的、基于QSAR的多尺度计算-实验工作流程，整合了分子对接、诱导匹配对接（IFD）、分子动力学（MD）、量子力学/分子力学（QM/MM）计算以及基于描述符的QSAR建模，以筛选出44种N-磺酰基三唑抑制剂。
QSAR建模使用了从E-Dragon软件中获得的分子描述符和量子力学（QM/QM/MM）参数，采用了多种回归技术。开发的模型包括普通线性回归、LASSO、Ridge、弹性网络、支持向量机（SVM）和梯度提升机（GBM）。在E-Dragon描述符上，SVM（测试R2=0.79，RMSE=0.49）和随机森林（测试R2=0.77，RMSE=0.52）表现出最佳的预测性能；而在QM描述符上，多元线性回归的拟合效果也非常出色（测试R2高达0.98，RMSE约为0.14）。影响活性的关键分子描述符包括氢键供体数量（ndonr）、极化率（AlogP）和拓扑指数（Jhetv）。
在这些QSAR模型的指导下，通过区域选择性的Cu(I)/Ru催化点击化学方法合成了候选化合物，并通过实验CTB-ELISA筛选确认化合物5d为最有效的抑制剂（IC??=11.78±1.2 μM）。计算研究一致支持这些发现，证明了候选化合物具有有利的结合能、动态适应性和最佳的电子互补性。
这种综合策略不仅提供了一种有效的、可合成的单价CTB抑制剂，还为快速设计和优化多价霍乱毒素拮抗剂提供了一个合理、数据驱动的平台，从而提高其疗效。
引言
霍乱仍然是一个全球性的健康问题，尤其是在卫生条件差和清洁水源有限的地区。致病菌霍乱弧菌（Vibrio cholerae）产生的霍乱毒素（CT）是一种AB?型毒素，会导致严重的脱水性腹泻，从而导致高发病率和死亡率。尽管口服补液疗法和疫苗接种策略有所进展，但霍乱爆发仍导致大量死亡，近年来死亡率甚至翻了一番[1]。也门和海地等国家的疫情日益严重，这凸显了迫切需要能够有效中和CT活性的靶向治疗干预措施[2][3]。每年全球有超过10万人死于这种由霍乱弧菌引起的严重脱水性腹泻疾病。最近的研究表明，霍乱弧菌可以侵入肠道并引发血液感染（菌血症）[4]。造成这种情况的主要是非产毒性的霍乱弧菌菌株（非O1/O139或NOVC）。虽然这些菌株不会引发流行病，但它们已成为导致血液感染的重要病原体[5]。
多价相互作用涉及结构良好的寡糖，这对霍乱毒素B亚单位（CTB）的结合和抑制至关重要，这一概念在之前的糖模拟抑制剂研究中得到了充分支持[6]。尽管我们的研究奠定了坚实的基础，但要实现最佳的多价结合仍然具有挑战性。并非所有五价系统都能表现出预期的5:5结合，尽管它们在结构上具有兼容性[7]。
Turnbull和Pieters的最新研究表明，非对称五价骨架——特别是那些通过额外添加糖单元功能化的四价树状大分子衍生的骨架——仍保持与其四价类似物相当的结合特性[8]。这些骨架不仅对霍乱毒素B亚单位五聚体（CTB）具有强亲和力，还能促进抑制所需的超分子聚集体的形成。然而，系统性的热力学研究仍然很少，限制了我们对多价结合机制的理解[9]。此外，在多价结构中选择连接单元及其长度往往基于经验，缺乏严格的结构-活性关系（SAR）分析[10]。优化五价对称骨架对于设计具有增强活性的下一代CT抑制剂至关重要。
追求最佳的霍乱毒素B亚单位（CTB）结合效果需要一种细致的方法，因为最大亲和力并不总是等同于最大的抑制效果。使用市售构建块合成GM1类似物的合成挑战强调了探索替代材料的重要性，这些材料应易于合成且性能优于传统的半乳糖衍生物[11]。在实际应用于霍乱高发地区时，必须选择能够在合成可及性和疗效之间取得平衡的材料[12]。CTB与岩藻糖化受体结合的晶体结构显示，岩藻糖残基与CTB上的次级结合位点相互作用[13]。这种次级相互作用增强了毒素与宿主细胞受体的整体结合亲和力，突显了岩藻糖化在CT附着和致病性中的重要作用[14]。
由于三唑在药物化学中作为酰胺的生物异构体具有公认的作用，包括增强的代谢稳定性、氢键形成能力和可调的电子性质，因此被选为我们的霍乱毒素B亚单位（CTB）抑制剂的核心骨架[15]。它们还能与CTB结合口袋中的关键残基发生π堆叠相互作用和氢键作用[16]。设计1,4-和1,5-取代三唑的依据是它们独特的空间取向，这些取向影响了配体-受体互补性和在GM1神经节苷脂（GM1）及次级岩藻糖结合位点的多价相互作用[17]。
将我们的单价N-磺酰基三唑系列与已知的霍乱毒素B亚单位（CTB）抑制剂进行比较，对于理解活性提升和指导未来骨架设计至关重要。早期的单价抑制剂如meta-硝基苯基β-D-半乳糖苷（MNPG）仅表现出中等的CTB亲和力（IC??=195 μM）[11d]，而基于蛋白质的五价MNPG抑制剂则能达到亚微摩尔级的抑制效果（IC??=0.9 μM）[16b]。相比之下，我们的候选化合物5d（IC??=11.78±1.2 μM）不仅填补了简单单价和复杂多价结构之间的空白，还提供了一种紧凑的点击化学骨架，为合成更高价结构的化合物铺平了道路。
虽然实验验证是金标准，但计算机模拟对于理解分子相互作用、指导结构-活性关系（SAR）洞察以及优化候选化合物至关重要。对接、分子动力学（MD）和量子力学/分子力学（QM/MM）计算被仔细整合在一起，以阐明所设计抑制剂的结合稳定性、电子性质和动态适应性。我们的QSAR建模专门针对我们定义的三唑化学数据集进行了开发，以确定控制其抑制活性的关键描述符[18]。通过系统地结合合成、计算分析和生物测试，本研究为开发具有增强疗效和特异性的下一代霍乱毒素抑制剂建立了合理的框架。
由于毒素活性位点的固有灵活性和动态构象变化，使用强效抑制剂靶向霍乱毒素B亚单位（CTB）仍然是一个艰巨的任务。CTB的结构可塑性，尤其是在容纳GM1神经节苷脂方面，要求配体设计策略既要优化构象适应性，又要确保目标特异性。传统的小分子抑制剂往往难以同时平衡亲和力和可调性，从而导致生物活性受损。在这项研究中，我们采用了基于QSAR的方法，设计了基于三唑的骨架，利用了CTB结合口袋内的关键氢键和疏水相互作用。计算对接和诱导匹配对接（IFD）模拟证实了我们设计的配体的动态适应性，确保了其与CTB结合位点的高互补性。进一步的分子动力学（MD）和量子力学/分子力学（QM/MM）分析阐明了各种取代基的电子和空间贡献，从而能够精确调节配体的亲和力和稳定性。实验ELISA检测验证了我们的计算预测，证明了其与GM1的有效竞争性。通过结合基于结构的设计、计算建模和实验验证，这项工作为解决配体可调性挑战提供了框架，并为下一代抗霍乱治疗药物的发展铺平了道路。
部分内容摘要
一般信息
所有试剂和溶剂均从商业供应商处购买，除非另有说明，否则按原样使用。反应通过硅胶板上的薄层色谱（TLC）进行监测，并在紫外光下观察。闪蒸柱色谱在60–120目硅胶上进行。核磁共振（NMR）谱在400 MHz光谱仪上记录，使用CDCl?或DMSO-d?作为内标，化学位移（δ）以ppm为单位报告。
一般合成程序
程序A（CuAAC）：叠氮化物和炔烃的混合物（1.1
结果与讨论
点击化学作为现代合成方法学的基石，因其高效性、选择性和构建复杂分子结构的多样性而被广泛使用。铜(I)催化的叠氮化物-炔烃环加成（CuAAC）就是这种方法的典范，能够在温和条件下实现1,4-取代-1,2,3-三唑的区域选择性合成。作为CuAAC的补充，钌（Ru）催化的叠氮化物-炔烃环加成已成为处理复杂情况的强大替代方法
结论
我们开发了一个强大的、综合的计算-实验平台，用于合理设计基于三唑的霍乱毒素B亚单位（CTB）抑制剂。通过结合分子对接、诱导匹配对接、QM/MM计算、QSAR建模以及区域选择性的点击化学合成，我们高效地设计并评估了44种化合物。我们的候选化合物5d表现出强烈的抑制活性，IC??为11.78±1.2 μM，这表明
CRediT作者贡献声明
Huma Basheer：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、可视化、方法学设计。
Chandra S. Azad：软件开发、实验研究、数据分析、数据管理。
M. Samim：验证、项目监督、软件使用、资源协调、资金获取、实验研究、方法学设计、项目管理、资源提供、软件支持、监督、验证、可视化、初稿撰写、审稿与编辑。
作者贡献
HB负责配体的制备，并基于计算研究解释了稳定性。HB还参与了克级合成以及MS和初步生物学评估。CSA进行了QSAR和NMR分析，IAK参与了合成和优化、数据整合及QSAR分析。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
所有作者感谢Anjali Sharma女士和Jagmohan先生的技术支持。所有作者感谢ICMR（奖项编号5/8-I/(11)/2020-ECD-II）和UGC（启动基金）提供的财政支持。
