《Computational Biology and Chemistry》：Integrated Analysis and Functional Validation Reveal KCNQ1 Tumor Suppressor Targeting by Dahuang Zhechong Pills via Cuproptosis Modulation in Colorectal Cancer
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本研究通过整合遗传因果验证与功能实验，探讨大黄蛰虫丸（DHZCP）通过DNA甲基化调控KCNQ1肿瘤抑制功能及杯罗蛋白尿途径抑制结直肠癌（CRC）的机制。SMR分析表明DNA甲基化负调控KCNQ1表达，体外实验证实DHZCP协同过表达KCNQ1显著抑制CRC细胞增殖、迁移、侵袭并诱导凋亡，同时通过调节氧化应激及细胞内铜离子积累增强疗效。网络药理学和分子对接预测了DHZCP的多靶点作用，为传统医学在精准肿瘤学中的应用提供了理论依据。
王鹏飞|董鹏鹏|耿志凯|龚一卓|崔文泽|宋文焕|刘一阳|于文豪|任连志|吕建涛|于明坤
中国山东省烟台市滨州医学院，264003
摘要
背景
结直肠癌（CRC）给人类带来了巨大的困扰。KCNQ1是一种可能的钾通道肿瘤抑制因子，但目前尚不清楚其在CRC中是否具有肿瘤抑制作用，以及是否受到表观遗传学的调控。大黄蛰虫丸（DHZCP）是一种具有抗肿瘤作用的传统中药，但其作用机制，尤其是与KCNQ1和铜死亡（cuproptosis）相关的通路，仍需进一步阐明。本研究的目的是通过结合遗传因果关系和功能验证，绘制出大黄蛰虫丸（DHZCP）的高分辨率作用机制图谱，从而提升传统中药在CRC治疗中的学术价值和临床应用前景。
方法
本研究采用了整合性的因果验证框架。利用基于汇总数据的SMR方法来测量甲基化对KCNQ1表达的因果效应，通过网络药理学和分子对接技术预测DHZCP的作用靶点，并在HCT-116结肠癌细胞中进行体外实验。在KCNQ1过表达（KCNQ1-OE）和DHZCP处理过的细胞中，研究了细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭、氧化应激以及铜死亡相关蛋白（FDX1、DLAT、LIAS）的表达情况。同时通过系统性的荟萃分析研究了DHZCP的临床疗效。
结果
SMR分析显示，KCNQ1的甲基化状态会抑制其表达。KCNQ1过表达可抑制HCT-116细胞的增殖、迁移和侵袭，并诱导细胞凋亡及氧化应激；而DHZCP处理后这些现象得到改善。DHZCP还能降低FDX1、DLAT和LIAS的表达水平，同时增加ROS、MDA和4-HNE的含量以及细胞内铜的含量。网络药理学研究表明DHZCP的成分可以直接与KCNQ1结合，并对CRC发挥多靶点作用。荟萃分析进一步验证了DHZCP在癌症治疗中的临床疗效。
结论
KCNQ1是一种受到DNA甲基化调控的CRC肿瘤抑制因子。DHZCP通过与铜死亡相关通路的调节，发挥抗CRC作用：促进铜死亡过程，增强氧化应激，并导致铜在细胞内积累，从而支持其在CRC治疗中的临床应用前景。
引言
2020年，全球新增190万例结直肠癌（CRC）病例和90万例死亡病例，这表明CRC已不再是遥远的威胁，而是全球主要的健康问题。值得注意的是，随着西方化生活方式（高热量饮食和缺乏运动）在低收入和中等收入国家逐渐普及，这些地区的发病率正以惊人的速度上升。尽管外科手术和靶向治疗取得了进展，但肿瘤复发、转移和耐药性等临床问题仍导致患者预后不佳。为了克服这些挑战，近年来人们广泛研究了多种具有潜在抗癌作用的物质。传统中药（TCM）在长期临床实践中积累了丰富的抗肿瘤经验。大黄蛰虫丸（DHZCP）是一种经典的中医方剂，其主要成分具有活血化瘀、清热解毒的功效。虽然传统上用于治疗内伤血瘀，但最近的研究表明它可能对多种肿瘤（包括CRC）具有抗肿瘤作用。与许多复合中药类似，DHZCP含有多种成分，其抗癌机制在分子层面尚未完全明了。系统生物学中的网络药理学方法为研究复合中药的作用机制提供了有力支持，但预测结果仍需通过实验验证。
近年来，表观遗传调控（尤其是DNA甲基化）在肿瘤发生和发展领域受到越来越多的关注。DNA甲基化失调可能导致肿瘤抑制基因表达下调或癌基因上调，成为CRC发生的关键因素之一。钾通道蛋白KCNQ1通常被认为对心脏的电生理特性至关重要，但研究发现它在多种肿瘤的发生和发展中也起着重要作用。目前尚不清楚KCNQ1是否在CRC中发挥作用，以及其表达是否受到DNA甲基化的调控。基于汇总数据的孟德尔随机化（SMR）分析可以利用遗传变异数据，从暴露因素（甲基化水平）推断观察数据中的结果因素（基因表达），为这一问题提供了新的解决途径。
代谢重编程是癌症的一个特征。铜诱导的细胞死亡（铜死亡）是一种新的程序性细胞死亡方式，与线粒体呼吸和细胞代谢过程密切相关。其核心机制是过量铜与脂酰化蛋白（如DLAT、LIAS、FDX1等TCA循环关键酶）结合，导致蛋白质聚集、铁硫簇耗竭和细胞死亡。这项研究的动机源于迫切需要通过多种方法应对CRC的耐药性和复发问题。尽管DHZCP在历史上已被证明有效，但缺乏明确的分子作用靶点限制了其在肿瘤学领域的应用前景。本文利用基于汇总数据的孟德尔随机化方法，试图突破传统的关联研究，明确KCNQ1的因果关系。此外，我们计划探索DHZCP与铜死亡通路之间的关联，为传统中药在精准肿瘤学中的整合提供理论基础；同时，纳米材料功能化平台的发展为调控中药的生物环境和氧化应激提供了新的研究方向。
方法和材料
本研究采用多方面方法探讨铜死亡在CRC中的作用，并评估大黄蛰虫丸（DHZCP）的潜在治疗机制。研究策略包括基于汇总数据的孟德尔随机化遗传关联分析、通过分子对接预测药物-靶点相互作用的网络药理学研究、在CRC细胞系中的实验验证，以及系统性的临床证据评估。
基于汇总数据的孟德尔随机化（SMR）揭示了特定甲基化位点对铜死亡相关基因表达的因果效应
基于汇总数据的孟德尔随机化（SMR）方法用于研究DNA甲基化对铜死亡相关基因表达的因果影响。该方法将甲基化定量性状位点（mQTLs）作为暴露变量，基因表达水平（eQTLs）作为结果变量进行因果推断。
分析结果表明（见表2），特定甲基化位点的状态对相关基因表达具有显著影响。
讨论
从技术角度来看，本研究具有较高的创新性，实现了跨层面的综合验证。与以往大多数基于单一实验模型的研究不同，我们采用了：（1）遗传因果关系分析：通过SMR确定了cg12578166和cg17035132作为KCNQ1的调控位点，将研究从关联关系提升到因果关系层面；（2）机制验证：KCNQ1（一种离子通道）能够调控铜死亡相关蛋白（FDX1、DLAT、LIAS），扩展了离子通道在癌症中的功能。
结论
本研究旨在弥合传统中药疗效与现代精准肿瘤学之间的差距。通过建立新的综合证据链，我们证明KCNQ1不仅是一个标记物，还是受DNA甲基化调控的肿瘤抑制因子。结果表明，大黄蛰虫丸（DHZCP）通过模拟和增强KCNQ1的功能，表现出显著的抗CRC活性。
伦理批准和参与同意
所有动物实验均遵循山东中医药大学实验动物福利伦理审查委员会的指导原则，并获得了该委员会的批准。
资助信息
作者声明本文的研究、创作和/或发表得到了资金支持。本研究得到了中国博士后科学基金和滨州中医院博士研究基金（ZY2024BSKY02）、以及滨州医学院中医药技术创新专项项目（2024ZYYZX06、2024ZYYZX08）的资助。
作者贡献声明
王鹏飞：撰写初稿、数据可视化、实验设计、概念构思。于明坤：数据可视化、项目监督、资金筹集、数据分析。吕建涛：项目监督、资金筹集、概念构思。刘一阳：结果验证、实验设计。宋文焕：结果验证、实验设计。任连志：项目监督、软件开发、数据管理。于文豪：资源协调、实验设计。耿志凯：实验设计、数据分析。
利益冲突声明
作者声明不存在利益冲突。
致谢
不适用。
临床试验注册
不适用。
利益冲突
作者声明不存在利益冲突。
