《International Journal of Biological Macromolecules》：A CRISPR/Cas12a-mediated marker-free fluorescent biosensor constructed based on an automated 3D DNA walker-enabled signal amplification for sensitive detection of aflatoxin B1
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CRISPR/Cas12a介导的3D DNA walker荧光生物传感器实现了黄曲霉毒素B1的高灵敏度检测，检测限达45.38 pg/mL，并成功应用于花生牛奶和饮用水样本的检测。
Jingwen Zhang|Biru Han|Xiru Zhang|Xinna Xie|Feng Zhao|Wei Zhang|Yujun Jiang|Xianlong Zhang
教育部乳品科学重点实验室，东北农业大学食品科学系，哈尔滨，150030，中国
摘要
高效且灵敏地检测霉菌毒素对于确保食品安全和维护全球公共卫生至关重要。在这项研究中，我们开发了一种基于CRISPR/Cas12a介导的无标记荧光生物传感器，该传感器利用自动化的3D DNA步行器实现“一对一多”的信号放大，用于灵敏检测黄曲霉毒素B1。由于DNA步行器的高效放大作用以及银纳米团簇的强荧光特性，通过精确调控Cas12a对特定目标DNA的切割活性，产生了灵敏的信号输出。在所建立的荧光生物传感器中，少量的黄曲霉毒素B1能够促使3D DNA步行器产生大量的激活剂，从而刺激Cas12a的切割活性，降解DNA单链并合成银纳米团簇，导致荧光信号减弱。该生物传感器在最佳条件下能够实现黄曲霉毒素B1的灵敏检测，在0.05至10 ng/mL的线性范围内检测限为45.38 pg/mL。此外，该生物传感器在不同浓度的添加样品（花生奶和饮用水）中表现出良好的回收率。这项工作为DNA步行器的应用以及基于CRISPR/Cas的无标记荧光传感平台的开发提供了新的见解。
引言
根据世界卫生组织的数据，每年约有200万人因霉菌毒素污染引起的疾病而死亡，这归因于霉菌毒素的高毒性[1]。在已知的霉菌毒素中，黄曲霉毒素是最具致癌性和毒性的化合物[2]。黄曲霉毒素B1（AFB1）是最常见且毒性最强的黄曲霉毒素亚组，被国际癌症研究机构明确列为I类致癌物[3]。AFB1具有稳定的化学结构，在加工过程中不易被破坏，并且会随着时间在食物链中积累。摄入后，AFB1会被微粒体混合功能氧化酶代谢，产生多种有毒物质，对公共卫生造成负面影响并导致经济损失[4]。因此，迫切需要开发一种灵敏可靠的AFB1检测方法。目前，传统的霉菌毒素检测方法（如HPLC和LC-MS）[5]通常存在许多局限性（例如设备昂贵、需要专业操作人员，且不适合快速现场检测大量样本），这限制了它们的广泛应用[6]。因此，开发快速灵敏的检测技术对于可靠地检测AFB1至关重要。
近年来，已经开发出用于便携式和快速检测AFB1的新技术，包括多种生物传感平台（如荧光法、比色法和电化学法）[7]。其中，荧光法因其优势（如高灵敏度、良好精度、稳定快速响应和操作简单）[8],[9]而被广泛使用。作为有效的基因编辑工具，CRISPR/Cas12a在编程的CRISPR RNA（crRNA）的引导下能够精确识别和切割含有PAM位点的目标DNA[10],[11]。当目标DNA被识别时，Cas12a蛋白的切割活性被激活，在任何单链DNA上表现出独特的切割活性[12],[13]。CRISPR/Cas12a技术非常适合提高荧光生物传感器的灵敏度，其进步也推动了从核酸到蛋白质等多种目标的分子检测[14],[15]。然而，在传统模型中，通常采用“一对一”的模式，即单个目标释放激活剂来触发CRISPR/Cas12a反应[16]。为了提高检测的灵敏度和适应性，CRISPR/Cas12a常与核酸扩增方法结合使用[17]。许多基于DNA的信号放大策略，如分支杂交链反应（HCR）和滚环扩增（RCA），表现出出色的信号放大能力[18],[19]。然而，这些与核酸检测预扩增技术结合的CRISPR/Cas12a方法使检测变得更加复杂，并可能增加交叉污染的风险[20]。为了解决上述问题，需要另一种合适的信号增强策略。最近，设计了一种名为“3D DNA步行器”的可编程步行器，建议将其与CRISPR/Cas12a结合使用，以利用其优势（如高度多功能性、适合现场检测和抗干扰性）[21]。3D DNA步行器是一种基于小型纳米颗粒的三维行走概念，由三个部分组成：行走链、行走轨道和驱动力。由于内切酶的强催化作用，它常用于实现轨道的自主定向移动[22]。通过DNA步行器的连续移动，只需一个目标就可以触发数百次循环扩增，从而积累放大信号，为提高检测灵敏度提供了有利基础[7]。更重要的是，它适用于转化各种目标（如小分子、蛋白质和核酸），改善了CRISPR/Cas12a在生物传感领域的局限性[21]。例如，Zhang等人提出了结合3D DNA步行器和CRISPR/Cas12a的协同作用，提供了一种快速且超灵敏的病原体检测策略[20]。Guo等人利用DNA步行器和CRISPR/Cas12a策略构建了一种新型超灵敏生物传感器，用于检测土霉素[7]。此外，Li等人开发了一种专门的多功能DNA步行器放大的“一对一多”CRISPR/Cas12a介导的荧光生物传感器，用于超灵敏检测miRNA-122[21]。然而，据我们所知，目前还没有将DNA步行器整合到CRISPR/Cas12a介导的AFB1检测生物传感器中的研究。
在传统的基于CRISPR/Cas的荧光生物传感器中，通常使用荧光团和淬灭剂双标记的荧光探针来生成检测信号[23],[24]。尽管这些技术获得了高灵敏度和广泛应用，但传统的荧光探针仍存在一些缺点，如光稳定性差、双标记使其制造成本高昂且繁琐[25],[26]。因此，需要开发创新的荧光纳米探针。近年来，DNA-AgNCs作为一种无标记荧光探针，在分析和检测领域引起了广泛关注，因为它们具有独特的优势（如高稳定性、良好的荧光特性和生物相容性）[27]。Ag+可以在DNA的成核区域还原，形成DNA-AgNCs，由于银的强量子限制效应，这些纳米颗粒具有发光特性[28]。此外，靠近富含G的DNA序列可以大大增加DNA-AgNCs的荧光强度，因为电子从鸟嘌呤传输到纳米颗粒[29]。
在这项研究中，利用CRISPR/Cas12a和DNA步行器技术构建了一种超灵敏的新型适配体生物传感器，用于检测AFB1。通过测量DNA-AgNCs在570 nm处的荧光衰减强度来量化AFB1。值得注意的是，所建立的基于适配体的生物传感器相比常见的适配体生物传感平台具有许多优势，主要包括以下几点：一方面，通过将DNA步行器与CRISPR/Cas12a结合，巧妙地实现了从单个目标释放多个激活剂的“一对一多”策略；另一方面，结合了富含G的DNA对DNA-AgNCs的荧光增强作用以及CRISPR/Cas12a的有效切割活性。总之，我们开发了一种创新的工具，能够方便且超灵敏地检测特定的霉菌毒素。通过将DNA步行器与CRISPR-Cas12a结合，显著提高了分析灵敏度，而无标记的DNA-AgNC荧光探针表现出出色的荧光特性。所开发的方法用于分析和检测AFB1，具有高灵敏度和出色的特异性，并已在实际食品样本中得到验证。
材料与设备
DNA标记物、琼脂糖、SuperRed核酸染料以及DNA探针和引物购自Sangon Biotech有限公司（上海，中国），而crRNA由Genscript Biotech有限公司（南京，中国）生产。所提出方法中使用的所有寡核苷酸列在补充材料（表S1）中。链霉亲和素功能化的MBs购自Beyotime Biotechnology有限公司（中国）。Cas12a、Nb.BbvCI、Buffer 2.1和rCutSmart Buffer购自New
CRISPR/Cas12a介导的荧光生物传感平台原理
所建立的生物传感器原理包括两个部分：DNA步行器和CRISPR/Cas12a精确调控的DNA-AgNCs的荧光响应（图1）。首先，AFB1被适配体特异性识别，少量的AFB1可以通过3D DNA步行器过程释放大量的激活剂。Cas12a的切割活性被激活，从而切割DNA-AgNCs探针，导致荧光信号减弱。在此过程中，首先在SMBs表面
结论
总之，基于DNA步行器的放大作用以及CRISPR/Cas12a精确调控的DNA-AgNCs触发的荧光响应，我们构建了一种超灵敏的无标记荧光生物传感器，用于检测AFB1。利用Cas12a的特异性识别和独特的信号转导特性、适配体的精细识别以及无标记DNA-AgNCs荧光探针的优异荧光特性，该方法具有出色的特异性
CRediT作者贡献声明
Jingwen Zhang：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，概念构思。Biru Han：撰写 – 审稿与编辑。Xiru Zhang：撰写 – 审稿与编辑。Xinna Xie：撰写 – 审稿与编辑。Feng Zhao：撰写 – 审稿与编辑，监督。Wei Zhang：软件，形式分析。Yujun Jiang：撰写 – 审稿与编辑，监督。Xianlong Zhang：撰写 – 审稿与编辑，监督，概念构思。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
本研究得到了国家自然科学基金（编号：32402229）和东北农业大学的科研启动资金（编号：54960612）的支持。
