《Advanced Powder Technology》：Continuous droplet freezing enables stable powder formulation of extracellular vesicles for therapeutic applications
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本研究采用连续滴滴冷冻（CDF）结合鼓式冻干技术制备牛乳来源外泌体（mEVs）粉末，结果显示CDF处理的粉末球形度高、表面光滑、流动性好，且在4℃下保持非晶态达六个月，细胞摄取效果与未处理mEVs相当，验证了CDF在稳定外泌体粉末中的有效性。
福田龙也（Tatsuya Fukuta）| 宫崎雅人（Masato Miyazaki）| 吉村琴音（Kotone Yoshimura）| 石原理人（Rikuto Ihara）| 中村晴彦（Haruhiko Nakamura）| 茂上春香（Haruka Mogami）| 刘武轩（Wuxuan Liu）| 池田今福真由美（Mayumi Ikeda-Imafuku）| 小玉智（Satoshi Kodama）| 松井孝（Ko Matsui）| 藤本泰基（Taiki Fujimoto）| 東志郎（Kenjirou Higashi）| 角田和則（Kazunori Kadota）
和歌山医科大学药学部物理药剂学系，日本和歌山市七番町25-1，邮编640-8156
摘要
细胞外囊泡（EVs）作为一种新型治疗方式具有巨大潜力。虽然它们在某些制剂中的应用已经得到了积极探索，但开发冻干型EV制剂对于确保长期稳定性和促进临床转化至关重要。然而，传统的冻干方法往往会导致重组后纳米颗粒聚集，从而影响制剂质量。本文介绍了一种连续滴液冷冻（CDF）技术，该技术使用精密滴液生成系统生成液滴，随后进行冻干处理，以制备含有牛乳来源EVs（mEVs）的球形粉末颗粒。采用这种CDF方法制备的制剂含有0.01 wt%的mEVs和10%的海藻糖，随后经过滚筒式干燥。与传统的托盘式冷冻干燥相比，CDF工艺生产的颗粒表面更光滑、球形度更高、Brunauer-Emmett-Teller表面积更大、安息角更小。值得注意的是，CDF处理的颗粒在4°C下可保持非晶态超过六个月，而托盘干燥的颗粒则表现出结晶性。CDF干燥的粉末具有优异的流动性和再分散性，重组后的粒径分布更为均匀。此外，从CDF粉末中摄取mEVs的效果与未经处理的mEVs相当。这些结果表明，CDF结合滚筒式冻干是一种制备稳定且功能性的EV粉末制剂的有效技术。
引言
细胞外囊泡（EVs）是细胞自然分泌的纳米级囊泡，由于其高生物相容性和内在的细胞靶向能力，近年来作为药物递送载体受到了广泛关注[1]。与脂质体等合成纳米载体不同，EVs含有来自母细胞的膜蛋白和脂质，这使得EVs能够选择性地与特定组织或细胞类型相互作用[2][3]。这些特性使EVs成为开发精准治疗的理想候选者[4]。基于这一潜力，人们探索了多种将EVs用于注射剂、外用制剂和口服悬浮液的形式[5][6][7]。然而，基于EVs的疗法的临床转化需要可靠的长期储存和运输方案，目前主要依赖冷链物流（通常在4°C或-80°C下进行[8]。大多数EV制剂为水基纳米悬浮液，粒径范围从几十纳米到几百纳米[9]。这些悬浮液在储存或处理过程中容易聚集和沉淀，从而影响其理化稳定性和治疗效果[10][11]。为了解决这些问题，EVs的干粉制剂成为一种有前景的替代方案。干粉EVs不仅稳定性更好，便于处理，而且可以在室温下储存。此外，最近的研究还展示了非侵入性给药途径（如肺部和鼻腔给药）的可行性[12][13]，这进一步扩展了EVs作为下一代药物递送系统（DDS）的应用范围。这些给药途径不仅避免了首过代谢，还能通过黏膜表面实现局部或全身给药，特别适合治疗呼吸系统疾病和中枢神经系统疾病[14][15]。尽管不是干粉制剂，但已有研究表明雾化形式的EVs在感染和神经退行性疾病治疗中具有应用潜力[16][17]。鉴于这些因素，EV粉末制剂有望克服当前EVs的局限性，充分发挥其治疗潜力。
冻干（lyophilization）长期以来一直被用作干燥热敏性和含水量高的材料的有效技术，尤其是在制药领域[18][19][20]。通过先将材料冷冻，然后施加低压使其升华而不产生热应力，冻干技术能够保护蛋白质等脆弱生物分子的结构完整性[21]。托盘式冻干机在制药生产中广泛应用，尤其是用于注射剂制剂，因为它们能够在低温下干燥活性成分[22]。然而，这种传统方法存在一些局限性，如温度分布不均、批次间差异以及可扩展性受限，这些因素限制了其在某些制剂中的应用[22][23][24]。为应对这些挑战，喷雾冷冻干燥（SFD）作为一种有前景的颗粒工程技术受到了越来越多的关注[25]。在该过程中，液体制剂被雾化成细小液滴，然后迅速冷冻并冻干。这种方法减少了热降解，产生的颗粒具有更小的粒径分布、更高的球形度以及多孔结构，从而提高了流动性和再分散性[24][26][27]。因此，SFD特别适用于制备基于纳米颗粒的制剂，如生物制品和先进的DDS[28][29]。不过，SFD也存在一些实际限制，包括设备要求复杂、产量低以及雾化过程中难以控制液滴大小[30]。对于像EVs这样具有治疗潜力的天然纳米颗粒，这些限制更加突出，因为需要在整个加工过程中保持膜完整性和生物活性。
本文采用了一种新颖的连续滴液冷冻（CDF）技术，该技术使用精密滴液生成系统生成均匀的液滴，这些液滴接触低温介质后迅速冻结。CDF提供了更温和的加工条件，能够精确控制液滴大小，并且比基于雾化的方法更具可扩展性。冻结后的液滴随后使用旋转滚筒式冻干机进行干燥，从而实现均匀的升华和高效的粉末回收。这种集成工艺特别适用于需要保持颗粒形态和生物活性的基于EV的制剂。
在本研究中，我们结合了CDF和滚筒式冻干技术，制备了含有牛乳来源EVs（mEVs）的球形粉末颗粒，并评估了mEVs的理化性质和生物活性，以建立一个稳健的EV粉末制剂开发平台。
牛乳来源的细胞外囊泡（mEVs）的收集
牛乳来源的EVs（mEVs）的收集方法如前所述[31]。具体步骤如下：脱脂后的牛乳在37°C下孵育10分钟，然后在乙酸存在下（牛乳/乙酸比例为100/1，v/v）在25°C下再孵育10分钟。随后在4°C下以10,000 × g的离心力离心10分钟（使用Allegra X-30R离心机；Beckman Coulter，东京，日本）。上清液通过0.22-μm膜过滤器过滤，然后在4°C下以125,000 × g的离心力超离心70分钟。
使用不同方法冻干mEVs
牛乳来源的mEVs采用先前的方法制备，该方法结合了酸沉淀和超离心[34]。所得mEVs的Z平均粒径、PDI值和ζ电位分别为124.8 ± 3.6 nm、0.17 ± 0.06和-34.2 ± 4.8 mV。mEVs悬浮液与10%海藻糖溶液混合，制剂的组成如表1所示，然后使用托盘式冻干机或CDF结合滚筒式冻干机进行冻干。
图1显示了冻干粉末的SEM图像
结论
本研究证明了结合精密滴液生成系统和滚筒式冻干的CDF技术在制备含有mEVs的粉末制剂方面的有效性。使用CDF方法制备的粉末颗粒形态均匀、球形且表面光滑，流动性良好。此外，CDF处理的粉末保持非晶态，在冷藏条件下至少可保存6个月。
作者贡献声明
福田龙也（Tatsuya Fukuta）：撰写初稿、项目管理、研究实施、资金获取、数据分析、概念构思。
宫崎雅人（Masato Miyazaki）：研究实施、数据分析。
吉村琴音（Kotone Yoshimura）：研究实施、数据分析。
石原理人（Rikuto Ihara）：研究实施、数据分析。
中村晴彦（Haruhiko Nakamura）：研究实施、数据分析。
茂上春香（Haruka Mogami）：研究实施、数据分析。
刘武轩（Wuxuan Liu）：研究实施、数据分析。
池田今福真由美（Mayumi Ikeda-Imafuku）：撰写、审稿与编辑。
利益冲突声明
作者声明以下可能被视为潜在利益冲突的财务利益/个人关系：福田龙也表示获得了日本学术振兴会的财务支持。角田和则表示获得了日本学术振兴会的财务支持。福田龙也还表示获得了日本Keirin Autorace基金会的财务支持。
致谢
本研究得到了日本学术振兴会（KAKENHI，资助编号23K06245和23K06284）、日本Keirin Autorace基金会以及Hosokawa Powder Technology基金会的资助。作者感谢同志社大学的白川良之教授在颗粒横截面SEM成像方面提供的帮助，同时也感谢Anton Paar公司在评估颗粒粒径分布和形态方面的支持。
