《Frontiers in Oncology》：Inhibition of colorectal cancer progression through conformation-specific targeting of ADAM10 metalloprotease
编辑推荐：
本综述聚焦于结直肠癌(CRC)治疗新靶点——金属蛋白酶ADAM10。研究首次系统评估了特异性靶向ADAM10活性（开放）构象的单克隆抗体1H5的治疗潜力。通过体外实验（细胞活力、迁移侵袭）和体内模型（异种移植、免疫健全小鼠），证实1H5能同时抑制Notch、EGFR/ERK和Wnt/β-catenin等多条致癌通路，显著抑制CRC细胞增殖、迁移并诱导代谢重编程。该策略克服了传统ADAM抑制剂毒性大的局限，为开发高选择性靶向疗法提供了新思路。
引言
结直肠癌(CRC)是全球癌症相关死亡的第二大原因，现有治疗方案主要依赖奥沙利铂或伊立替康为基础的联合化疗，并结合抗体介导的EGFR或VEGF信号抑制，但这些方案常伴随显著副作用，限制其长期应用效果。ADAM10因其在激活Notch、EGFR等致癌通路中的关键作用，成为CRC潜在治疗靶点。然而，先前靶向ADAM10的方法显示出高毒性。ADAM10存在开放（活性）和闭合（自抑制）两种构象，其中活性构象在肿瘤细胞中更普遍，这为构象特异性靶向提供了理论依据。
1H5单抗降低结直肠癌细胞系体外生长潜力
研究首先通过Alamar Blue法检测了1H5对三种遗传背景不同的CRC细胞系（COLO205、SW620、DLD-1）活力的影响。结果显示，1H5处理72小时后，所有细胞系均呈现剂量依赖性的活力降低，其中COLO205和DLD-1细胞活力降低约60%，SW620降低约40%。值得注意的是，在正常胎儿人结肠(FHC)细胞中，1H5处理仅引起Alamar Blue信号的轻微变化，且未达到统计学显著性，也缺乏在CRC细胞中观察到的剂量依赖性抑制效应，支持1H5对癌细胞的作用具有偏好性。
实时活细胞成像进一步显示，1H5显著降低了所有细胞系的增殖，尤其在COLO205和DLD-1细胞中效果最强。长期克隆形成实验也表明，5 μg/mL的1H5即可导致所有测试的CRC细胞系形成菌落的能力出现剂量依赖性的显著下降。这些结果共同证明，1H5能有效抑制CRC细胞的代谢活性、增殖和克隆形成生长。
诱导性ADAM10敲低证实1H5在CRC细胞系中的靶点特异性
为确定1H5的靶点特异性，研究人员尝试通过可诱导的RNA干扰(RNAi)技术特异性降低ADAM10的表达。使用针对ADAM10的shRNA（shADAM10_1和shADAM10_2）进行多西环素(dox)诱导后，所有三种细胞系中ADAM10蛋白水平均显著降低。增殖实验显示，与对照shRenilla细胞相比，ADAM10敲低的细胞增殖减慢，尤其在COLO205和DLD-1细胞中。当用40 μg/mL的1H5处理时，对照细胞显示出显著的生长抑制，而ADAM10敲低细胞则对处理表现出明显的抵抗性。这些发现证实1H5通过ADAM10发挥其抗增殖活性，支持其靶点特异性，并验证了ADAM10在CRC中的功能性依赖。
1H5抑制结直肠癌细胞系中的Notch信号通路
研究人员接下来表征了ADAM10的下游靶点，重点关注了CRC细胞系中的Notch和EGFR信号。免疫印迹分析显示，COLO205和SW620细胞表现出活跃的Notch信号，而DLD-1细胞主要显示EGFR通路激活。用浓度递增的1H5处理COLO205和SW620细胞，可抑制Notch信号，表现为尽管总Notch蛋白持续表达，但NICD表达缺失。低至5 μg/mL的浓度即可观察到显著抑制，其效果与γ-分泌酶抑制剂(GSI)相当。与NICD水平下降一致，定量PCR分析显示1H5处理后，这两种细胞系中HES1 mRNA表达减少，证实了有效的Notch通路抑制。在COLO205异种移植模型中的剂量反应实验进一步证实，1H5处理可显著抑制肿瘤生长，且动物体重无变化，表明治疗耐受性良好。对收获肿瘤的评估显示，1H5处理组动物Notch活性显著降低，进一步证实了体内的有效通路抑制。
1H5抑制DLD-1细胞中的EGFR/ERK信号通路并抑制代谢基因表达
鉴于DLD-1结直肠癌细胞在缺乏Notch激活的情况下显示活跃的EGFR信号，研究人员假设1H5可能通过阻断ADAM10介导的配体剪切来抑制这种替代性致癌通路。用5或20 μg/mL的1H5处理DLD-1细胞后，免疫印迹显示磷酸化EGFR呈剂量依赖性减少，其效果与临床批准的EGFR酪氨酸激酶抑制剂吉非替尼相当。总EGFR水平保持不变，表明1H5特异性损害受体活化而非蛋白表达。通过评估ERK磷酸化检查下游MAPK信号，发现1H5处理导致磷酸化ERK(p-ERK)水平相应下降，进一步支持了EGFR驱动信号的抑制。
为评估1H5更广泛的转录组影响，研究人员对1H5处理的DLD-1细胞与对照IgG处理的细胞进行了RNA测序。KEGG通路富集分析显示，多个代谢通路显著下调，包括嘌呤和嘧啶代谢。与此一致，观察到几个关键代谢调节因子（如MYC、LDHA、PYCR1等）的表达降低。相比之下，一部分应激和损伤反应基因被上调，包括JUN，其诱导可能反映了对ADAM10抑制的适应性应激或炎症反应。这些发现表明，1H5不仅能有效抑制EGFR/ERK信号，还能破坏对CRC增殖至关重要的代谢和生物合成基因的表达，突出了其即使在缺乏活跃Notch信号的CRC细胞中也具有治疗潜力。
1H5在DLD-1异种移植小鼠模型中有效抑制体内肿瘤生长
鉴于1H5在DLD-1细胞中具有强大的体外活性，研究人员接下来评估了其体内疗效。通过将DLD-1细胞皮下植入雌性NU/J裸鼠建立异种移植模型，随后每周两次给予20 mg/kg的1H5或同型IgG对照，持续21天。与对照组动物相比，1H5处理显著抑制了肿瘤生长，这通过随时间测量的肿瘤体积反映出来。重要的是，未观察到显著的体重减轻，表明1H5耐受性良好。这些发现证明了1H5的体内抗肿瘤功效和耐受性，支持其作为EGFR活性结直肠癌治疗候选药物的持续开发。
1H5降低SW620转移性结直肠癌细胞的迁移和侵袭并调节Wnt/β-catenin信号
鉴于转移是CRC患者死亡的主要原因，研究人员评估了1H5对转移性SW620细胞系迁移和侵袭特性的影响。划痕实验表明，与IgG处理的对照组相比，用1H5（20或40 μg/mL）处理48小时后显著降低了细胞迁移。与此一致，Transwell侵袭实验显示，1H5处理后穿过下层膜的细胞数量明显减少。为探索这些表型变化背后的分子机制，对1H5处理的SW620细胞进行了RNA测序。通路富集分析显示Wnt/β-catenin信号通路显著下调。转录组分析显示关键Wnt/β-catenin靶基因（如NKD1、NOTUM和S100A5）显著下调，同时Wnt拮抗剂DKK1的表达显著上调。RT-qPCR验证了这些发现。为功能性地评估对Wnt/β-catenin信号的影响，进行了TOPFlash报告基因实验，该实验通过TCF/LEF反应元件驱动的荧光素酶表达来量化β-catenin/TCF介导的转录活性。与IgG处理的对照组相比，1H5处理的细胞显示出显著降低的β-catenin驱动的荧光素酶活性，证实了ADAM10阻断后Wnt信号的有效抑制。除了这些转录组变化，Western印迹分析表明，1H5处理增强了E-钙粘蛋白表达，支持细胞粘附增加，并促进了β-catenin的胞浆积累，而核β-catenin水平基本不变——这一观察结果值得进一步研究。
1H5在KAP结直肠癌类器官体外和同系小鼠模型中减弱肿瘤生长
众所周知，免疫细胞显著影响结直肠癌的肿瘤微环境，并且根据具体情况，免疫细胞浸润可能对全身治疗的成功产生积极或消极影响。因此，研究人员着手在更具生理相关性、免疫健全的环境中评估1H5的疗效，即使用基因工程3D小鼠结直肠癌类器官。使用了携带常见CRC驱动突变并表现出激活Notch信号的KAP类器官和BAP类器官。用1H5处理可显著降低每种类器官模型在48和72小时后的活力。与预期的作用机制一致，免疫印迹分析证实治疗后Notch通路激活受到抑制。为评估体内治疗潜力，将KAP类器官皮下植入免疫健全的C57BL/6野生型小鼠的腹胁部。每周两次给予30 mg/kg的1H5导致与IgG处理的对照组相比肿瘤生长显著减少。20 mg/kg的处理也减少了肿瘤生长，但程度较轻。为排除针对治疗性抗体的小鼠抗人抗体(MAHA)反应的发生，在每次注射后收集血清样本。对这些样本进行的MAHA检测显示在整个治疗过程中未检测到抗体反应。
讨论
ADAM10是一种关键的剪切酶，调节多种跨膜蛋白（包括生长因子配体和粘附分子）的蛋白水解释放。在CRC中，ADAM10是促进下游蛋白活性增强的重要因素，从而增强增殖、侵袭和存活信号。尽管其在癌症进展中起核心作用，但由于其与其他ADAM蛋白酶的结构相似性限制了小分子的特异性，靶向ADAM10一直具有挑战性。本研究评估了1H5，一种构象特异性单克隆抗体，能选择性结合ADAM10的开放、活性形式，该形式主要在恶性细胞上表达。虽然先前关于ADAM10在结直肠癌中的研究大多局限于其在Notch信号中的作用，但我们的工作更广泛地揭示了其在CRC进展中的功能贡献，以及在不同遗传背景的CRC模型中靶向其活性构象的治疗潜力。
我们的数据证实1H5在异质性CRC模型中发挥广泛的抗肿瘤活性。除了在具有高Notch活性的CRC细胞系中抑制Notch信号——导致异种移植模型中相对低剂量下显著的肿瘤生长减缓——1H5在EGFR驱动的CRC背景中也显示出强大的活性。已知ADAM10剪切EGFR配体如EGF和betacellulin，在我们的EGFR驱动的CRC模型中，1H5以与减少配体驱动信号一致的方式抑制了EGFR和ERK的激活，尽管未进行配体剪切的直接测量。这些效应延伸至体内，1H5处理产生了强大的肿瘤生长抑制，且通过体重测量和一般动物状况评估未出现明显的毒性迹象。
这些在EGFR活性细胞系中的发现尤其重要。首先，配体剪切已被证明是ERBB和EGFR依赖性通路中耐药性的驱动因素，表明抑制配体剪切代表了一个独特的治疗脆弱点，可能有助于克服CRC中的耐药性。然而，必须认识到ADAM10并非调节ERBB配体的唯一剪切酶；ADAM17也是EGFR配体激活的主要贡献者，并在某些情况下可以补偿ADAM10活性的缺失。因此，1H5的效果可能受到不同CRC模型中ADAM17相对表达或活性的影响，未来的研究需要确定ADAM17介导的剪切是否调节或限制了ADAM10阻断的完全治疗效果。其次，对EGFR抑制剂另一个已确立的耐药机制是其他ERBB家族成员（如CRC中的HER3）的代偿性激活。鉴于ADAM10在介导多种ERBB配体剪切中的作用，1H5的抑制有可能同时抑制这些代偿通路，从而拓宽其治疗益处，特别是与西妥昔单抗或帕尼单抗等EGFR靶向抗体联合使用时。重要的是，其对ADAM10活性构象的选择性确保了精确的肿瘤靶向，对正常组织影响最小。
我们进一步证明，1H5在转移性CRC细胞中减弱Wnt/β-catenin信号的能力尤其重要，因为该通路是CRC中最常失调的通路之一——主要由于APC突变——并且是肿瘤进展、干性和转移的主要驱动因素。此外，在mRNA和蛋白水平上E-钙粘蛋白表达的恢复，以及核心EMT转录因子SLUG表达的减少，表明细胞粘附增强和侵袭能力减弱。与此表型一致，1H5处理的SW620细胞也显示出CDH24表达增加，CDH24是一种与增强上皮粘附和减少运动性相关的钙粘蛋白。这些发现为靶向转移性CRC开辟了新途径，其中有效遏制Wnt/β-catenin活性的策略仍然是关键的未满足需求。尽管核β-catenin水平未变，但Wnt靶基因表达的减少可能反映了转录输出的下游调节，包括对TCF/LEF活性、辅因子相互作用或染色质可及性的潜在影响，而非β-catenin丰度的变化。同时，我们注意到DUSP5的上调，DUSP5是一种核MAPK磷酸酶，能抑制ERK信号；尽管SW620不是EGFR驱动的细胞系，但DUSP5升高可能反映了ADAM10抑制后更广泛的MAPK通路调整的代偿反应。
同时，我们在不同的体内环境中评估了1H5。虽然在异种移植研究中观察到强大的治疗效果，但在免疫健全的同系模型中的治疗显示肿瘤生长减少，尽管效果不如在人类CRC异种移植中明显，但通过体重和MAHA反应监测确认了安全性。与此一致，我们注意到体外携带KrasG12D的KAP类器官与携带BrafV600E的BAP类器官之间存在差异，后者似乎反应更佳。这些发现表明，潜在的遗传背景可能影响对ADAM10抑制的治疗反应性。总之，这些结果强调了遗传背景在塑造对ADAM10抑制敏感性方面的重要性，并值得进一步研究。
总的来说，我们的数据表明，构象特异性靶向ADAM10通过抑制ADAM10依赖的Notch和EGFR信号，在CRC中具有强大的治疗前景。重要的是，与早期使用非构象特异性抗体的方法相比，我们的策略未导致可检测的毒性或不必要的副作用。这赋予了高度的特异性，最大限度地减少了脱靶活性，并强调了1H5作为CRC和其他ADAM10高表达恶性肿瘤治疗候选药物的转化潜力。除了其作为阻断抗体的活性外，1H5对ADAM10活性、肿瘤相关构象的选择性结合也使其成为抗体药物偶联物(ADC)开发的有吸引力的原型，其独特的靶点结合可用于将细胞毒性载荷直接递送至恶性细胞，从而拓宽其治疗效用。
