《Frontiers in Immunology》：Metabolite analysis of Aspergillus fumigatus conidial supernatant and its pro-inflammatory activity in vitro and in vivo
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本研究通过非靶向代谢组学分析烟曲霉分生孢子萌发前后（Af293-4h vs Af293-12h）上清液的代谢差异，发现萌发后有机酸、脂质、生物碱等代谢物分泌显著增加。体外实验证实Af293-12h上清液通过激活JAK/STAT/AKT和MAPK信号通路，更强力诱导小鼠肺泡巨噬细胞（MH-S）产生IL-1β、TNF-α等炎症因子。体内实验构建小鼠长期鼻腔滴注分生孢子上清液模型，成功诱发肺炎伴肺组织损伤和炎症细胞浸润。该研究揭示了分生孢子萌发过程中的代谢重编程及其在驱动宿主炎症反应中的关键作用，为理解烟曲霉致病机制提供了新视角。
烟曲霉分生孢子萌发过程的形态学特征
研究首先系统观察了烟曲霉菌株Af293分生孢子从0到12小时早期萌发过程的形态学特征。通过光学显微镜、DAPI核染色以及扫描电子显微镜观察发现，分生孢子在4小时进入显著吸水膨胀期，6小时部分孢子开始萌发，至12小时绝大多数孢子完成萌发，进入芽管生长阶段。DAPI染色结果显示，在吸水膨胀期即可观察到核分裂的变化，而在极性生长阶段核数量进一步增加。分生孢子萌发率在6至12小时期间显著升高。研究还选取了萌发前（0小时）、极性生长期（6小时）和芽管生长期（12小时）三个时间点，检测了极性生长相关基因Rho、RasA和Rac的mRNA表达水平，发现与0小时相比，6小时和12小时时这些基因的mRNA水平均显著上调。这些结果表明，Af293分生孢子在不同的萌发阶段呈现出鲜明的形态特征，且具有明确的时间依赖性。
分生孢子上清液的总体样本差异分析
鉴于萌发前后分生孢子形态存在显著差异，研究者推测其分泌的代谢物在此过程中也可能发生动态变化。研究聚焦于萌发前（4小时，Af293-4h，代表吸水膨胀期，尚未产生可见芽管）和萌发后（12小时，Af293-12h，代表早期菌丝长出期，已建立极性生长）两个关键时间点的分生孢子上清液进行代谢组学分析。主成分分析（PCA）结果显示，第一主成分贡献率为50%，第二主成分贡献率为15.1%，组内样本点分布集中，但组间呈现明显的分离趋势。为进一步探究代谢物差异，采用了正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA），结果显示两组样本间存在显著差异。模型的200次置换检验验证表明，R2 = 0.89大于Q2 = -0.49，且Q2回归线与Y轴截距小于0，证明模型具有良好的预测能力和稳健性，能准确反映样本信息。
分生孢子上清液的差异代谢物分析
基于OPLS-DA模型，根据变量重要性投影（VIP）值大于1、p值小于0.05以及倍数变化（FC）大于2或小于0.5的标准进行筛选。火山图分析显示，与Af293-4h组相比，Af293-12h组中有40种代谢物上调，101种代谢物下调。这些差异代谢物主要包括有机酸及其衍生物、脂质和类脂分子以及有机杂环化合物。对VIP值排名前50的显著差异代谢物进行层次聚类分析，热图清晰展示了两组样本间代谢物丰度的显著差异。与Af293-4h组相比，Af293-12h组中Atherosperminine、Cyclo(L-Phe-L-Pro)、(2z,4z)-2-Hydroxyhexa-2,4-Dienoic Acid等代谢物丰度显著升高，而5-Methylfuran-2-Carboxylic Acid、Pectachol、Fapy-Adenine等代谢物丰度则显著降低。VIP值排名前十的差异代谢物中，下调的包括Leu Met、腺苷（adenosine）等，上调的除热图中显示的8种外，还包括次黄嘌呤（Hypoxanthine）和肌苷（Inosine）。
差异代谢物的KEGG通路富集分析
KEGG通路富集分析旨在探索差异代谢物与代谢途径之间的关联。结果显示，在萌发期（Af293-12h）相较于吸水膨胀期（Af293-4h），显著上调的通路包括亚油酸（linoleic acid）代谢、赖氨酸降解和色氨酸（tryptophan）代谢。显著下调的通路则主要富集在亚油酸代谢、ABC转运蛋白、苯丙氨酸/酪氨酸/色氨酸生物合成、虾青素生物合成、氨酰-tRNA生物合成、多种次级代谢物的生物合成以及嘌呤代谢等途径。这表明分生孢子萌发伴随着活跃的代谢通路重编程。
分生孢子上清液诱导的MH-S细胞炎症反应
尽管已知烟曲霉分生孢子可引发巨噬细胞炎症反应，但不同时间点分生孢子上清液对巨噬细胞炎症反应的影响尚不清楚。研究用Af293 4小时和12小时的上清液处理小鼠肺泡巨噬细胞（MH-S），并通过ELISA和RT-qPCR评估炎症因子表达。ELISA结果显示，Af293-4h和Af293-12h上清液均能诱导炎症因子IL-1β和TNF-α的表达，且Af293-12h组的诱导水平显著高于Af293-4h组。RT-qPCR结果进一步表明，与Af293-4h组相比，Af293-12h组细胞中IL因子（如IL-1β）、趋化因子（如CCL-2、CCL-7、CXCL-2、CXCL-3）以及金属蛋白酶（如MMP-9、MMP-13）的mRNA水平均显著升高。这证实了萌发后分生孢子上清液能诱导更强的炎症反应。
分生孢子上清液通过激活JAK-STAT和MAPK通路诱导炎症
烟曲霉感染可激活包括JAK-STAT和MAPK在内的多种炎症通路，但这些通路是否可由分生孢子上清液诱导尚未见报道。为探究此问题，研究使用能诱导更强炎症反应的Af293-12h分生孢子上清液（CS）刺激MH-S细胞，并通过Western blot（WB）检测JAK1、STAT1、AKT、JNK、ERK等关键炎症信号通路蛋白的总水平及其磷酸化水平。结果显示，CS处理12小时后，这些蛋白的磷酸化水平显著升高，表明相关通路被激活。为阐明CS激活哪些信号通路导致炎症反应，研究使用了AKT抑制剂（AZD5363, 50uM）和磷酸化-ERK抑制剂（PD98059, 50uM）来抑制相应通路蛋白，并评估下游炎症因子的变化。WB证实AZD5363和PD98059能有效抑制AKT和磷酸化-ERK的表达。ELISA结果显示，这两种抑制剂均能显著降低CS诱导升高的IL-1β和TNF-α浓度。RT-qPCR结果进一步显示，AZD5363显著降低了IL-1β、TNF-α、CCL-2、CXCL-2和MMP9的mRNA水平，而PD98059则导致IL-1β、CXCL-2、MMP9和MMP13的mRNA水平降低。这些发现表明，CS-12h通过促进多种炎症相关蛋白的磷酸化，刺激MH-S细胞产生更高水平的炎症因子。
分生孢子上清液诱导的小鼠肺部炎症
分生孢子上清液能在体外刺激MH-S细胞产生炎症反应，但其在体内能否诱导肺部炎症尚不明确。为解决此问题，研究通过连续一个月对小鼠进行分生孢子上清液鼻腔滴注，建立了小鼠肺炎模型（CSLI组），对照组则滴注PBS。苏木精-伊红（HE）染色显示，CSLI组小鼠肺组织出现炎症细胞浸润和肺气肿，表明分生孢子上清液造成了肺组织损伤。吉姆萨染色细胞学分析显示，与对照组相比，CSLI组小鼠支气管肺泡灌洗液（BALF）中巨噬细胞和中性粒细胞显著增加，淋巴细胞虽有增加但无统计学意义。在分子水平上，ELISA结果显示CSLI组小鼠BALF中促炎细胞因子（TNF-α、IL-1β和IL-6）水平显著升高。肺组织炎症标志物的RT-qPCR分析也印证了这一结果。总之，该研究成功建立了由分生孢子上清液诱导的慢性小鼠肺炎模型，为深入研究宿主与Af293分生孢子上清液的相互作用提供了可靠平台。
讨论
本研究首次系统阐明了烟曲霉分生孢子萌发过程与其致病性之间的动态关系。随着分生孢子萌发，烟曲霉发生显著的代谢重编程，并伴随毒素积累。非靶向代谢组学分析揭示了分生孢子萌发后有机酸及其衍生物、脂质和类脂分子、酚类化合物、苯丙素类、聚酮化合物以及生物碱及其衍生物的分泌增加。此外，其分泌组的代谢特征及其诱导宿主炎症反应的能力是动态的，并随时间显著增强。与萌发前上清液相比，萌发后上清液在体外诱导的炎症反应显著更强。这些次级代谢物通过JAK/STAT/AKT和MAPK通路在体外激活宿主炎症反应。因此，研究分生孢子上清液介导的炎症反应是对分生孢子感染机制的重要补充，为全面理解烟曲霉的致病过程提供了重要见解。
形态学观察表明，分生孢子在4至12小时间从休眠状态转变为活跃萌发状态。这两个时间点涵盖了萌发前后主要的代谢状态差异，有助于识别与萌发启动相关的关键代谢物和通路改变。与此一致，质谱分析显示这两个时间点上清液中的代谢物存在显著差异。总体而言，烟曲霉中的色氨酸代谢通路显著上调。现有文献证实烟曲霉产生多种含色氨酸的毒素。色氨酸为这些毒素的合成提供了必需的结构组件。鉴于人类和其他哺乳动物无法合成色氨酸，烟曲霉自主产生该氨基酸的能力使其能够在营养有限的环境（如宿主肺部）中维持生长并持续合成毒素。这一代谢优势使真菌在感染过程中占据主导地位，而不依赖于宿主提供的色氨酸。另一方面，结果表明烟曲霉萌发过程中亚油酸代谢通路显著上调。其他研究也证实烟曲霉通过特定的氧化酶系统代谢亚油酸。此外，研究证实内源性产生和分泌的二羟基氧化脂酸5,8-diHODE可调节丝状真菌的分化过程。这些发现提示，萌发中的分生孢子并非被动释放物质，而是主动进行“代谢重编程”，可能改变其与宿主免疫系统相互作用的性质。
功能实验证实了这些代谢改变的生物学后果。研究首先证明Af293-12h分生孢子上清液在细胞模型中比Af293-4h上清液诱导了更多的炎症细胞因子释放。研究者推测CS-12h增强的促炎能力可能源于某些代谢物的积累，例如二酮哌嗪类化合物。其中Cyclo(L-Phe-L-Pro)已有报道。这些可被视为胶霉毒素及其相关霉菌毒素的核心骨架或直接生物合成前体。升高的代谢物(2Z,4Z)-2-羟基己-2,4-二烯酸基于其化学结构，可能是聚酮化合物生物合成途径中的关键中间体或降解产物。某些显著增加的代谢物，如次黄嘌呤和肌苷，可能在烟曲霉的适应性生存和持续生长中发挥作用。对于烟曲霉而言，鞘氨醇对于维持细胞壁完整性和毒性至关重要。鞘脂信号对于真菌生物膜的形成至关重要，而生物膜对于持续性感染和耐药性至关重要。在这些差异代谢物中，需要进一步实验确认哪些特定代谢物负责炎症反应。
由烟曲霉分生孢子感染引发的炎症被描述为一个“双相”过程。炎症的初始阶段主要由分生孢子表面的病原体相关分子模式（PAMPs）与宿主模式识别受体之间的物理相互作用启动，导致快速而强烈的信号传导。后期与分生孢子萌发和菌丝形成相吻合，以效应分子（包括毒素和蛋白酶）的持续分泌为特征，这些分子持续加剧和放大炎症反应，可能导致更严重的宿主细胞损伤。先前研究表明烟曲霉分生孢子可刺激宿主细胞并激活PI3K/AKT、JAK/STAT和MAPK通路的磷酸化。本研究发现分生孢子上清液刺激导致细胞内炎症蛋白磷酸化水平升高，包括PI3K/AKT、JAK/STAT和MAPK通路。此外，抑制ERK和AKT导致炎症因子IL-1β、TNF-α和CXCL-2显著降低。一项研究显示烟曲霉分生孢子可激活BEAS-2B上皮细胞中的MAPK信号通路，诱导细胞因子产生。值得注意的是，应用JNK抑制剂逆转了烟曲霉在BEAS-2B细胞中诱导的炎症因子分泌，而p38 MAPK和ERK抑制剂则不影响这些过程。这种差异可能源于上皮细胞和巨噬细胞之间MAPK通路的差异。另一项研究中，BEAS-2B细胞暴露于烟曲霉分生孢子激活了AKT/mTOR通路，导致细胞炎症和凋亡。此外，烟曲霉分生孢子通过JAK/STAT信号通路刺激树突状细胞释放细胞因子，促进Th17反应。这些研究表明分生孢子或其上清液可通过激活多种信号通路促进炎症反应。通过在小鼠模型中重复鼻腔暴露于烟曲霉分生孢子证实了曲霉介导的过敏性气道炎症。另一项研究显示，免疫功能正常的小鼠经烟曲霉分生孢子攻击后表现出明显的炎症反应，其特征是支气管肺泡灌洗液巨噬细胞数量增加和炎症因子表达升高，这与肺损伤相关。这些发现与本研究通过一个月鼻腔滴注烟曲霉分生孢子上清液建立的免疫功能正常小鼠肺炎模型结果一致。因此，长期鼻腔暴露于分生孢子上清液或分生孢子可在小鼠中诱发类似的肺部炎症。
结论
研究表明，烟曲霉分生孢子上清液的代谢物在萌发前和萌发后阶段存在显著差异。分生孢子上清液可通过激活JAK/STAT/MAPK通路诱导巨噬细胞产生显著的炎症反应。小鼠长期暴露于孢子上清液可导致肺炎和组织损伤。因此，针对这些特定代谢物或其激活的炎症通路制定预防或干预策略具有重要潜力。
