《Frontiers in Neuroscience》：First computational characterization of HTR5A-AS1: a schizophrenia-linked antisense RNA with synaptic functions
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本综述首次系统表征了与5-羟色胺受体基因HTR5A反义的长链非编码RNA（lncRNA）HTR5A-AS1。研究整合转录组关联研究（TWAS）、死后脑组织RNA测序（RNA-seq）和BrainSpan发育转录组数据，证实HTR5A-AS1在海马体和背外侧前额叶皮层（dlPFC）与精神分裂症显著相关，其表达在患者海马体中显著降低且呈现发育调控和性别二态性。功能预测提示其可能参与突触和GABA能信号通路，为理解精神分裂症的发病机制提供了新视角。
背景/目的
精神分裂症是一种高度遗传的精神疾病，全球患病率约为1%。全基因组关联研究（GWAS）已将大多数精神分裂症风险变异定位到非编码区，凸显了调控过程和非编码RNA在病理中的作用。尽管精神分裂症与5-羟色胺（血清素）系统功能障碍相关，但HTR5A-AS1（一个与5-羟色胺受体基因HTR5A反义的长链非编码RNA）仍几乎未被研究。本研究首次对HTR5A-AS1进行了系统表征，验证其转录本结构，并研究其遗传关联、表达动态、发育调控以及在精神分裂症中潜在的突触和GABA能功能。
方法
研究整合了转录组关联研究（TWAS）摘要统计数据、死后脑组织RNA测序（RNA-seq）数据、BrainSpan发育转录组、UCSC基因组浏览器注释和功能预测工具。这些互补的方法使得能够验证转录本结构、量化区域和发育表达，并评估潜在的分子功能。
结果
HTR5A-AS1在海马体和背外侧前额叶皮层（dlPFC）显示出与精神分裂症的显著TWAS关联。在精神分裂症捐赠者的死后脑组织中，海马体中的表达显著降低，dlPFC中也存在不显著但方向相似的降低；按性别分层分析显示，海马体的降低在男性捐赠者中最为明显。平行分析显示，配对的受体基因HTR5A在海马体中有适度的下调，同样主要由男性驱动。发育转录组揭示了区域特异性的发育轨迹，在青春期期间表达急剧增加，这与精神分裂症的典型发病年龄范围一致。HTR5A-AS1与HTR5A强烈共表达，功能预测提示其参与突触和GABA能信号传导，这与精神分裂症中的皮质-海马环路破坏一致。
结论
这些发现首次证明HTR5A-AS1是一种真正的反义转录本，具有发育和突触作用，可能贡献于精神分裂症风险。未来的单细胞和功能扰动研究需要测试因果关系并明确调控机制。
1 引言
精神分裂症是一种严重的精神疾病，大约影响全球2100万个体。环境因素如母亲压力和青少年大麻使用可能贡献于患病风险，但遗传因素是核心风险成分，遗传力约为80%。GWAS已识别出287个遗传变异和120个与精神分裂症相关的基因，其中大多数风险位点位于非编码区，突出了调控过程和非编码RNA的重要性。精神分裂症也被广泛认为是一种神经发育障碍，症状通常在青春期或成年早期出现。大脑区域的结构和功能异常，特别是前额叶皮层和海马体，与疾病密切相关。5-羟色胺（血清素）系统也一直与精神分裂症的病理相关，尤其是通过其在情绪、认知和感觉处理中的作用。虽然HTR2A和HTR1A等血清素受体被广泛研究，但HTR5A的作用在很大程度上仍未探索。转录组关联研究（TWAS）通过整合GWAS摘要统计数据和表达数量性状位点（eQTL）数据，提供了一种解决基因-疾病关联的方法。最近的一项TWAS研究识别出反义于HTR5A的长链非编码RNA（lncRNA）HTR5A-AS1的表达与精神分裂症风险显著相关。
2 材料与方法
2.1 转录组关联研究
使用R软件分析Collado-Torres等人的TWAS结果，清理基因标识符并过滤出HTR5A-AS1或其Ensembl ID（ENSG00000220575）的行，识别跨脑区的最强转录组关联。对配对的有义基因HTR5A也进行了平行分析。
2.2 连锁不平衡分析
使用LDlinkR包计算精神分裂症GWAS哨兵SNP（rs1583830）和主导外显子水平eQTL SNP（rs1881691）之间的成对连锁不平衡（LD）。
2.3 死后表达分析（BrainSeq）
将死后脑组织的大块RNA测序表达数据加载到R中，提取HTR5A-AS1及其有义配对基因HTR5A的表达值，转换为每百万计数（CPM），并过滤仅包括成年捐赠者（至少18岁）的海马体和dlPFC样本。使用Wilcoxon秩和检验评估对照组和精神分裂症样本之间的组间差异。所有分析均按生物性别（男性 vs 女性）分层重复。
2.4 发育表达轨迹（BrainSpan）
从BrainSpan大块RNA测序数据中提取HTR5A-AS1的表达轨迹。将报告的样本年龄解析为受孕后天数（PCD），并绘制相对于log10缩放PCD的表达值。拟合线性回归模型（TPM ~ PCD）以量化全局发育趋势。将样本元数据从BrainSpan结构缩写映射到广泛的解剖类别，并对六个表达最高的区域独立拟合线性回归模型。
2.5 UCSC基因组浏览器验证
使用UCSC基因组浏览器（hg38组装）确认HTR5A-AS1的存在和转录结构，检查基因座并启用包括dbSNP构建155、GENCODE v48注释、CLS转录本模型等多个轨道。
2.6 功能预测（lncHUB）
从lncHUB平台获取HTR5A-AS1的功能预测，包括KEGG通路Z值、哺乳动物/MGI小鼠表型Z值、基因本体（GO）生物过程Z值和共表达基因Z值。将导出的结果表读入R并进行处理，生成排名水平条形图。
3 结果
3.1 TWAS识别HTR5A-AS1与精神分裂症的关联
在海马体中，HTR5A-AS1最强的TWAS关联在外显子连接点水平检测到（Z = -3.99, p = 6.52 × 10?5, FDR = 2.93 × 10?3）。在dlPFC中，HTR5A-AS1的一个外显子水平特征也达到统计学显著性（TWAS Z = -3.54, p = 4.06 × 10?4, FDR = 1.04 × 10?2）。GWAS哨兵SNP（rs1583830）和外显子水平eQTL SNP（rs1881691）处于中度至强连锁不平衡（LD; D′ = 0.82, r2 = 0.60, p = 1.0 × 10?4），表明相同的单倍型块驱动精神分裂症风险关联和HTR5A-AS1调控。相比之下，配对的有义基因HTR5A的平行TWAS分析在两个区域均未显示转录组范围内显著的关联。
3.2 海马体中HTR5A-AS1表达降低
对来自对照组和精神分裂症捐赠者的900个脑样本（海马体n = 447，dlPFC n = 453）的死后原始计数RNA测序数据进行分析。在海马体中，精神分裂症样本中HTR5A-AS1的表达显著低于对照组（p = 0.0193，Wilcoxon秩和检验）。在dlPFC中，精神分裂症的表达较低但未达到统计学显著性（p = 0.0954）。
3.3 HTR5A-AS1和HTR5A的按性别分层的死后表达
在海马体中，HTR5A-AS1在男性患者中与男性对照组相比表达名义上较低（p = 0.0731），而在女性中未观察到显著差异（p = 0.1785）。在dlPFC中，HTR5A-AS1在女性（p = 0.7322）或男性（p = 0.0871）样本中均未显示显著的病例对照差异。在海马体中，当所有成年人一起考虑时，HTR5A表达适度但显著降低（p = 0.0182），这种效应主要由男性驱动（p = 0.0406），在女性中不显著（p = 0.2548）。相比之下，dlPFC中的HTR5A表达在合并（p = 0.6581）、仅女性（p = 0.7752）或仅男性（p = 0.6589）样本中，精神分裂症和对照组捐赠者之间没有显著差异。
3.4 人脑中的区域特异性表达
使用来自BrainSpan的RNA测序数据分析HTR5A-AS1在精神分裂症中最常受破坏区域的表达模式。表达在小脑皮质（CBC）中最高，其次是初级体感皮层（S1C）、后颞上皮层（STC）和顶下皮层（IPC）。
3.5 HTR5A-AS1的发育轨迹
对从产前到成年阶段的脑RNA测序数据进行分析显示，在整个生命周期中存在动态变化。所有样本的线性回归显示整体的阳性发育轨迹（β≈0.0004 TPM/天）。按区域分层的线性拟合显示，HTR5A-AS1表达在不同脑区以不同的速率上升，小脑皮质（CBC）的增长率最快，其次是新皮层（NCX）和纹状体（STR）。
3.6 通过UCSC基因组浏览器和共表达分析进行转录本验证
UCSC基因组浏览器分析（hg38组装）证实了脑组织中与GENCODE注释基因座重叠的多外显子转录本。精神分裂症相关的SNP出现在HTR5A-AS1基因座的上游。在524个样本中，HTR5A-AS1表达与HTR5A强烈相关（Pearson's r = 0.943, p < 2.2 × 10?16）。
3.7 HTR5A-AS1的预测功能关联
来自lncHUB的通路富集和共表达分析提示与突触传递、学习和成瘾相关的通路可能强烈富集。顶级KEGG通路是肌萎缩侧索硬化（ALS），其次是尼古丁成瘾和长时程增强。预测的小鼠表型强调了与短期空间参考记忆异常、听觉电生理异常和外周突触传递异常的关联。基因本体（GO）富集识别出GABA能突触传递、细胞调控的分泌过程和γ-氨基丁酸信号通路为顶级生物过程。对前500个共表达基因的分析揭示了许多已知的突触和神经元调节因子。
4 讨论
本研究首次在精神分裂症背景下详细表征了反义于血清素受体基因HTR5A的长链非编码RNA HTR5A-AS1。TWAS分析识别出HTR5A-AS1表达与精神分裂症之间的两个显著关联：海马体的连接点水平信号和dlPFC的外显子水平信号。表达分析揭示了精神分裂症脑捐赠者海马体中HTR5A-AS1表达显著降低，与TWAS预测一致。发育分析表明HTR5A-AS1是发育调控的，具有不同的区域特异性轨迹，与精神分裂症的发育起源一致。多个独立的证据线验证了该转录本的真实性。功能预测和共表达分析一致提示突触和认知过程，特别是GABA能信号和长时程增强。按性别分层的死后分析进一步细化了这一图景，表明HTR5A-AS1可能以区域特异性和性别二态性的方式贡献于精神分裂症风险。尽管HTR5A-AS1显示出稳健的TWAS关联，但有义基因HTR5A在海马体或dlPFC中未达到转录组范围内的显著性。存在几个局限性和未来方向，包括功能预测的相关性、需要共定位分析、强共表达使功能解释复杂化、大块组织RNA测序的局限性以及需要整合表观基因组数据集。未来的实验研究可以利用这些发现，使用扰动方法来测试涉及HTR5A-AS1的特定调控假设。
