《Frontiers in Immunology》：CyTOF profiling identifies location-specific peripheral immune checkpoint and immune cell subset in mild ischemic stroke
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本综述通过高维质谱流式技术（CyTOF）系统揭示了轻度缺血性脑卒中（MIS）患者外周免疫应答的时空动态特征，首次明确了皮质与皮质下梗死部位对免疫细胞亚群分化（如经典单核细胞CD14+CD16-、CCR5+CD8+T细胞）及免疫检查点（PD-1/PD-L1、Tim-3等）表达模式的差异化调控，为卒中后个体化免疫干预策略提供了关键理论依据。
1 引言
缺血性脑卒中作为局灶性脑血管事件，可引发系统性免疫应答，其进程涵盖急性神经炎症与外周免疫抑制两个重叠阶段。单核细胞被迅速募集至缺血脑区并分化为具有促炎（M1样）或抗炎/修复（M2样）功能的巨噬细胞；T细胞则通过CD4+辅助T细胞（Th1/Th2极化）、调节性T细胞（Tregs）及CD8+细胞毒性T细胞参与损伤调控。免疫检查点分子如程序性死亡受体-1（PD-1）及其配体（PD-L1）在卒中后表达上调，通过调节T细胞活性影响炎症进程与感染风险。然而，既往研究多局限于横断面设计或少数标志物，难以捕捉免疫应答的动态演化。高维质谱流式细胞术（CyTOF）可实现在单细胞水平同步分析免疫亚群与检查点表达，但针对患者的纵向研究仍匮乏。此外，梗死部位（皮质与皮质下）通过差异化的神经免疫信号通路可能塑造外周免疫特征，但相关直接比较研究有限。
2 材料与方法
研究纳入10例轻度缺血性脑卒中（NIHSS≤5）患者与5例匹配健康对照，根据弥散加权成像（DWI）将患者分为皮质梗死组（n=5）与皮质下梗死组（n=5）。于发病后第1、3、7天采集外周血样本，通过42标志抗体Panel进行CyTOF检测，利用X-shift算法对CD45+白细胞进行聚类分析，并通过t-SNE可视化免疫亚群分布。统计学分析采用单因素方差分析（ANOVA）或曼-惠特尼U检验比较组间差异，标记物表达值经反双曲正弦变换（cofactor=5）标准化。
3 结果
3.1 研究队列特征
两组患者在年龄、性别比例及基础疾病（高血压、糖尿病）方面匹配，皮质梗死组高血压患病率较高（80% vs 40%）。实验室检查显示卒中患者单核细胞计数与单核细胞/高密度脂蛋白（HDL）比值轻度升高。
3.2 免疫细胞亚群动态
CyTOF鉴定出11类主要免疫亚群，包括B细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、单核细胞（经典、中间型、非经典）、树突状细胞（cDCs、pDCs）等。皮质下梗死组经典单核细胞频率持续升高（第1天P=0.008，第7天P=0.001），而中间型单核细胞显著降低（第1天P=0.011，第7天P=0.015）；皮质梗死组则表现为单核细胞频率轻度增加及CD4+T细胞短暂减少。
3.3 髓系细胞检查点表达
PD-1在树突状细胞与经典单核细胞上的表达于皮质梗死组呈渐进性升高，而皮质下梗死组则下降（树突状细胞第3天P=0.0098）。PD-L1在中间型单核细胞上的表达于第7天在皮质梗死组回升，皮质下组持续降低（P=0.007）。CD172a、TIGIT、Tim-3、VISTA等其他检查点未显示组间显著差异。
3.4 CD4+T细胞亚群调控
皮质下梗死组调节性T细胞（Tregs）频率持续高于对照（第7天P=0.042），皮质组则低于对照。PD-1在Tregs上的表达于皮质组升高，皮质下组无变化（第3天P=0.0349）；Tim-3在NK样CD4+T细胞中于皮质组上升、皮质下组下降（第1天P=0.0029）。
3.5 CD8+T细胞异质性
皮质梗死组中央记忆CD8+T细胞（CM）频率第3天降低（P=0.049）。PD-1在终末效应CD8+T细胞（EMRA）中于皮质组持续上升，皮质下组无响应（第7天P<0.0001）；Tim-3在NK样CD8+T细胞中呈现类似分化趋势（第1天P=0.0038）。
3.6 CCR5定义CD8+T细胞功能状态
皮质下梗死组CCR5+CD8+T细胞显著富集（全时间点P<0.0001），其PD-L1（第7天P=0.0368）与Tim-3（第3天P=0.0009）表达均降低；CCR5-亚群则频率减少且VISTA表达下调（第1天P=0.0061）。
4 讨论
本研究通过高维免疫图谱揭示了梗死部位对外周免疫重塑的决定性影响。皮质下梗死倾向于维持髓系主导的炎症状态（经典单核细胞持续扩增、检查点信号延迟），而皮质梗死则更早启动适应性免疫调节（T细胞亚群动态变化及PD-1/ Tim-3快速上调）。CCR5+CD8+T细胞在皮质下梗死中的特异性富集提示其可能作为炎症趋化的关键媒介。这些发现为基于梗死定位的免疫表型分型及靶向治疗提供了新视角。
5 局限性
样本量较小、仅关注轻度卒中、缺乏绝对细胞计数及更长时程观测，未来需结合梗死体积量化与扩展标志物Panel深化研究。
6 结论
梗死部位是轻度缺血性脑卒中外周免疫重塑的关键决定因素，皮质与皮质下梗死呈现截然不同的免疫动力学特征与检查点调控模式，这为发展部位适应性免疫干预策略奠定了理论基础。
