《Frontiers in Ecology and Evolution》：A non-invasive footprint technique for accurate identification of cryptic small mammal species: a sengi case study
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本研究开发了一种非侵入式足迹识别技术（FIT），通过形态计量学分析和线性判别分析（LDA），成功实现了对两种形态相似的隐秘性象鼩物种（Elephantulus myurus 和 Elephantulus intufi）的高精度（94-96%）鉴别。该方法利用定制的小型哺乳动物参考足迹（SMaRT）盒采集足迹图像，结合JMP软件进行特征提取与统计分析，为生物多样性监测提供了一种实用、低成本的工具，有望提升物种分布图准确性并加强保护成效。
引言
生物多样性正以前所未有的速度衰退，然而实用且成本低廉的物种监测工具却十分有限。本研究提出了一种灵活、非侵入式的足迹识别技术（FIT），将其作为一种评估和监测生物多样性的指标。FIT根植于传统生态知识，使其特别适合当地社区的参与。
小型哺乳动物群落作为生物指示剂已在多种环境背景下被研究，它们是全球陆地生态系统的关键组成部分。在南部非洲，它们可能占哺乳动物物种总数的30%以上。其种群动态和物种组成对环境变化（包括植物物种未能指示的干扰）反应迅速。因此，该类群被认为是南部非洲生物多样性监测协议和管理计划中最重要的组成部分之一。能够准确识别它们对于理解和管理栖息地需求、保护规划和管理至关重要。
传统的监测方法包括活捕和夹捕，它们依赖于劳动密集型的野外工作，通常成本高昂，需要重复的捕捉作业以及专家的物种识别和处理能力。
本研究探索使用FIT来区分南非两种隐秘的象鼩物种的足迹。象鼩是南部非洲生态系统监测中使用的宝贵小型哺乳动物群落组成部分，特别是在气候变化影响方面。
材料与方法
术语定义
足迹指单只脚掌留下的可见印记。足迹板是用于收集足迹的平整表面，通常铺有纸张或木炭。足迹隧道是带有足迹板的通道，允许动物通过并留下足迹。SMaRT（小型哺乳动物参考足迹）盒是用于从小型哺乳动物收集参考足迹的定制装置。
研究地点
东部岩象鼩（E. myurus）的足迹采集自位于南非姆普马兰加省和豪登省交界处的Telperion自然保护区的岩石露头。该保护区具有草地、岩石露头、峡谷和湿地等多种栖息地。Telperion位于南非夏季降雨区，年降水量在570毫米至730毫米之间。夏季平均气温日最低为15.1°C，最高为26.4°C。二月是最热的月份，七月是最冷的月份，日平均最高气温为18.4°C，最低为4.2°C。该地区以起伏的丘陵、开阔的高原和陡峭的斜坡为特征。
丛林象鼩（E. intufi）均来自Tswalu卡拉哈里保护区的沙丘谷地。这个私人保护区位于南部卡拉哈里边缘，拥有多样化的丛林地带、平原和山地灌木地带、沙丘地带和石灰质灌木地带栖息地，支持着丰富的野生动物。Tswalu卡拉哈里保护区位于南非干燥的南部卡拉哈里地区。降雨通常发生在夏季（12月至2月），而冬季（6月至8月）干燥。年平均降雨量为360 ± 170毫米。气温范围冬季约为6°C，夏季可达41°C。地貌以沙质平原和平行的沙丘为特征，而石英岩质的Korannaberg山脉位于保护区的东半部。
分布图绘制
为了了解当前这两种象鼩物种分布图存在的潜在不确定性和差异，以及足迹识别对于完善小型哺乳动物分布范围的潜力，我们绘制了IUCN专家定义的分布范围数据，并叠加了来自全球生物多样性信息机构（GBIF）和iNaturalist的两种物种的发现地点数据。我们还绘制了本研究中经过基因验证的捕捉地点位置，以检查它们与已确立位置的相对关系。
参考库采集
开发用于小型哺乳动物物种分类的足迹识别模型需要为每个目标物种收集足迹参考数据库，用于训练模型。这是一个一次性的过程。两种象鼩物种使用小型哺乳动物PVC活捕陷阱捕获。陷阱使用花生酱、燕麦和马麦酱的标准混合物作为诱饵，并包含一个棉球以在极端温度下提供 insulation。陷阱每天检查两次。
足迹在距离捕获点约300米内的阴凉、安静且相对凉爽的临时野外实验室从被捕获的动物身上收集，并在足迹采集后立即在精确的捕获点释放。
为了收集用于物种模型开发的参考足迹，将动物个体释放到定制的小型哺乳动物参考足迹（SMaRT）盒中。这个封闭的木盒内部尺寸为550 x 270毫米，深度为175毫米，具有四个木制侧面和一个有机玻璃滑动顶盖。顶盖上放置两个可移动的纸板条，为动物创造一个黑暗、压力最小的环境，同时仍允许观察。夜行性物种在不被处理时保持在黑暗安静的环境中。
粘性厨房接触纸附着在盒子底部，粘性面朝上。木炭粉以非常薄的层刷在接触纸两端的短边。动物从一端进入盒子，走过木炭区，在其脚底收集一层细小的无毒木炭粉。足迹随后被转移到纸张上。一旦收集到足够的足迹，将动物引导回陷阱中，并在其最初被捕获的确切位置释放。哺乳期的雌性优先处理和释放。
图像预处理与特征提取
足迹图像随后使用JMP统计发现软件中的统计形态计量学流程进行处理。选择前脚足迹用于区分这两个物种，原因有二：首先，仅需要四个可能足迹中的一个简化了数据收集；其次，观察到后脚足迹存在相当大的变异，推测可能与它们用后脚“敲击”进行警报通信的行为以及其非常长的后脚因姿势和步态不同而印记方式各异有关。
特征提取和所有统计分析均在JMP统计软件中进行。图像被导入JMP中的一个定制插件中进行特征提取。这允许进行图像操作并在每个足迹上放置七个标志点，这些点是根据在大量足迹中肉眼可 consistently 识别的标准选择的。随后在JMP中基于标志变量的相互作用生成了另外21个衍生点。利用每个图像上的比例尺，我们编码了77个距离、14个角度和8个面积等一系列潜在重要的指标。这个过程已针对包括具有不同足部解剖结构、步态和进化起源的其他物种（如渔貂、黑犀牛、猎豹、低地貘和大熊猫）进行过描述。
结果
使用足迹区分隐秘物种
从前脚足迹共收集到18只丛林象鼩（E. intufi）和19只东部岩象鼩（E. myurus）个体的数据，性别比例均衡。
通过逐步线性判别分析（LDA）并根据其F比值（排除相关变量后）选择了九个变量，并按显著性水平排列。例如，区分两个物种的最佳变量是V7，即连接内侧趾（点1）质心到内侧腕垫（点7）质心的距离。仅基于V7的单变量ANOVA物种分类准确率达到99.9%。然而，仅基于单个变量进行分类是不安全的，因为这种方法极易受到自然变异、物种间重叠以及可能与物种身份无关的外部因素影响形态的误导。
为了确保选择最佳数量的变量以提供良好的分类效果而不过度拟合，我们绘制了所选变量数量与由此产生的物种分类准确率的关系图。曲线在九个变量处达到渐近线。
随后进行了LDA，使用表3中选定的九个变量来评估物种分类的准确率水平。LDA返回的训练数据集准确率为94.8%，验证集和测试集的准确率为95.6%。基于单张图像，物种分类的总体准确率为96%。
通过将数据按相同比例（60:20:20）随机划分为训练、测试和验证类别，并迭代10次分析，进一步测试了分类的准确性。三个类别的平均准确率约为94-95%。
比较物种分布范围
通过绘制来自IUCN专家定义范围和GBIF/iNaturalist发现点数据的两种物种分布数据，我们观察到两个数据集在范围估计上存在明显差异。每个物种的一些发现点落在了专家定义的范围之外。如果使用GBIF/iNaturalist发现点来定义物种分布重叠区，这些点将导致更大的重叠。
在本研究中，我们在Tswalu卡拉哈里地点（图9中左侧的紫色点）偶然发现两种物种在相距120米的范围内共存，那里它们偏好的岩石和沙地栖息地相接。值得注意的是，这个发现点落在了专家推导的东部岩象鼩（E. myurus）分布重叠区之外。
讨论
使用足迹识别区分隐秘物种
本研究证明，FIT能够稳健地区分两种隐秘的象鼩物种，实现了96%的分类准确率，并且在迭代随机数据分区中交叉验证的准确率达到94-95%。这一方法学进展为无创监测提供了可能，并凸显了FIT在野外应用中的可靠性。
平衡的数据集、与成本效益高且本地可获取的硬件的结合，以及在JMP软件中端到端的流程，最大限度地减少了采样偏差，并简化了收集、注释和分析过程。通过逐步F比值选择确定的判别变量以及通过10次随机分区进行的验证，进一步证实了FIT在隐秘物种识别方面的稳健性。
主要的创新在于使用可本地采购、成本低廉、能减少处理压力、受伤和疾病传播风险的设备，客观地识别形态相似的物种。FIT也适用于难以捕捉或避阱的物种，并且可扩展用于更广泛的保护和生态研究。
足迹识别作为增强分布图信心的方法
FIT为支持小型哺乳动物（占全球哺乳动物多样性的30-40%）的监测和分布图绘制提供了一种快速准确的方法。结合对小型哺乳动物对环境变化响应的了解，FIT有潜力对我们理解这些生态系统的健康状况产生显著的积极影响。
IUCN专家边界、GBIF/iNaturalist观察点以及本研究野外捕捉地点之间的比较揭示了对于东部岩象鼩（E. myurus）和丛林象鼩（E. intufi）的范围预测存在显著差异。
重要的是，我们并非将这些GBIF/iNaturalist点和IUCN边界视为实际物种范围的忠实反映；然而，这些数据集被广泛用于各种物种的分布图绘制工作中，我们呈现其不一致的结果是为了突出当前识别本研究中两种象鼩物种（可能还有其他隐秘物种）方法的局限性。差异部分源于GBIF/iNaturalist中社区来源记录比例较高，而IUCN依赖于专家判断，两者都容易受到错误识别、采样偏差、时间覆盖不完整以及缺乏缺失数据等问题的影响。虽然整合两个数据源可以减轻一些偏差并改进互补性绘图，但观察到的不一致性凸显了对更可靠、更快速的物种识别方法的迫切需求，特别是对于近缘分类群。这样的改进可以极大地提高分布图的准确性，并支持在研究不足或数据缺乏地区进行有针对性的生物多样性调查。
局限性与潜在不足
本研究仅使用了两种隐秘象鼩物种和有限数量个体的足迹。需要使用相同方法描述来自不同生态系统的更广泛的南非小型哺乳动物物种。
该方法依赖于一定的技能和经验来处理小型哺乳动物以收集参考数据集。
图像的形态计量学解释需要一些对足迹解剖结构的熟悉度。非专家需要在数据分析方面进行初步培训。
我们对IUCN专家地图和GBIF观察数据集的比较仅作为一个起点，揭示了物种范围估计中存在的显著且常被忽视的差异。通过展示广泛使用的数据集如何产生相互矛盾的结果，这项工作有力地说明了开发稳健、可扩展的识别方法的紧迫性。将这种方法扩展到更大的地理区域将允许严格评估FIT在改变物种绘图准确性方面的潜力，并解决生物多样性知识中长期存在的空白。
为了全面了解该技术的潜力，应进行一项研究，详细比较FIT识别与其他替代或互补的非侵入性技术（如环境DNA（eDNA）和相机陷阱）的适用性或准确性。
下一步计划
与当地科学界更积极地互动，并将传统生态知识（TEK）整合到基于FIT的监测中，将显著提高数据质量、保护有效性和长期管理能力。开放式隧道将允许对甚至避阱的物种进行非侵入式、无需接触的识别。重要的是，正在开发的机器学习模型将能够从足迹中快速进行物种级检测，为追踪栖息地和气候变化下的生物多样性和生态完整性提供可扩展的工具。FIT有望成为一个关键的催化剂——将科学专业知识与土著追踪知识联系起来，扩大先进监测工具的获取途径，并确保参与式、本地知情的管理和保护成果。
