《Frontiers in Endocrinology》：Multi-gene co-mutations of BRAF with TERT, PIK3CA, or TP53 are powerful predictors of central lymph node metastasis in papillary thyroid carcinoma
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本研究通过整合下一代测序（NGS）与临床病理特征，构建并验证了甲状腺乳头状癌（PTC）术前淋巴结转移（LNM）风险预测模型。核心发现是，BRAF V600E与TERT、PIK3CA或TP53的高危多基因共突变是中央区淋巴结转移（CLNM）最强的独立预测因子（OR=6.319）。该分子引导策略为个性化手术规划（如淋巴结清扫范围）提供了精准工具，尤其在微小癌（microPTC）主动监测决策中展现出重要价值。
背景
甲状腺乳头状癌（PTC）是最常见的内分泌恶性肿瘤，约占所有甲状腺癌病例的80%。虽然其总体预后良好，但诊断时颈部淋巴结转移（LNM）的高发生率，尤其是中央区（CLNM）和侧颈区（LLNM）转移，构成了重大的临床挑战。术前准确评估LNM状态至关重要，因为它直接影响是否进行以及进行多大范围的预防性淋巴结清扫，进而影响肿瘤学结局和手术相关并发症。
目前，术前风险分层主要依赖于超声检查和临床病理特征，如肿瘤大小和位置。然而，影像学对于检测CLNM，特别是隐匿性转移的敏感性和特异性仍不理想。此外，尽管某些临床因素与较高风险相关，但它们缺乏真正个体化手术计划所需的精确性。
在精准医学时代，分子标志物已成为优化风险评估的有力工具。BRAF V600E突变是PTC中最常见的遗传改变，其与更具侵袭性的临床病理特征（包括LNM）的关联已被广泛研究。然而，BRAF V600E作为独立标志物的预测能力常存在争议，且似乎不足以单独指导手术决策。这一局限性揭示了肿瘤发生的复杂性，并提示PTC的侵袭行为可能并非由单一基因驱动，而是由多种遗传改变的协同效应所致。例如，TERT（促进细胞永生）、PIK3CA（增强侵袭）和TP53（使细胞凋亡失能）等基因的共存突变被假设与BRAF协同作用，导致更具转移性的表型。
尽管近期研究增进了我们对特定双重突变的理解，但更广泛的、预定义的多基因组合（特指BRAF与TERT、PIK3CA和/或TP53共突变）的协同效应、它们对LNM模式（CLNM vs. LLNM）的不同影响，以及最关键的是，它们被整合到术前临床预测模型中的可量化价值，仍未得到充分探索。
材料与方法
本研究为单中心、回顾性、探索性研究，旨在探讨将多基因共突变模式整合到术前风险评估中的可行性。研究纳入了2022年6月至2025年1月期间在德阳市人民医院经术后病理诊断为PTC、并接受了下一代测序（NGS）检测的所有连续患者（n=521）。
纳入标准包括：术后组织病理学证实为PTC；有来自手术标本的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）肿瘤组织可用于分子检测；完成了标准化的NGS检测。排除标准包括：有任何其他恶性肿瘤病史；既往接受过甲状腺癌治疗（如放疗、化疗或靶向治疗）；临床病理或分子数据不完整。
NGS检测作为标准诊断流程的一部分，在术后对原发肿瘤的FFPE组织切片进行。所有组织病理学特征均由两名委员会认证的病理学家根据世界卫生组织（WHO）分类标准独立审查确认。手术程序包括甲状腺叶切除+峡部切除/全甲状腺切除+中央区/侧颈区淋巴结清扫。
靶向测序使用基于标准化商业流程的实验室自建检测方法进行。从FFPE肿瘤样本中提取基因组DNA，使用针对甲状腺癌的88基因靶向测序 panel进行测序文库构建。该 panel 覆盖了BRAF、TERT、RAS、TP53和PIK3CA等关键驱动基因。测序在Illumina平台上进行，平均测序深度>500×。
统计分析使用SPSS 25.0软件进行。分类变量以频数（%）表示。组间差异采用单因素分析（卡方检验或Fisher精确检验）。将单因素分析中P < 0.05的变量纳入多因素二元Logistic回归分析，以确定独立风险因素。结果以比值比（OR）和95%置信区间（CI）表示。最终多变量模型的判别能力通过一致性指数（C-index）进行评估，并使用1000次重复的Bootstrap抽样进行内部验证和过拟合校正。
结果
基线特征与基因突变分布
本研究共纳入521例PTC患者。大多数为女性（72.4%）且年龄小于45岁（65.5%）。大多数肿瘤直径≤1厘米（55.7%）、单灶（77.2%）、为经典型（95.6%）。淋巴血管侵犯（LVI）存在于8.6%的病例中。BRAF V600E突变非常普遍（82.1%），而被定义为BRAF V600E与TERT、PIK3CA和/或TP53共突变的高危多基因共突变相对罕见（3.8%）。
在所有标本中，94.43%（492/521）检测到突变。单一点突变或基因融合突变检出率为88.48%（461/521），而多基因共突变（≥2个）检出率为5.95%（31/521）。其中，3.84%（20/521）为BRAF与TERT/PIK3CA/TP53共突变。5.57%（29/521）的标本未检测到突变。
CLNM和LLNM的风险因素
单因素分析显示，CLNM发生率为54.70%（285/521）。男性、年龄<45岁、肿瘤大小>1厘米、双侧病灶、高危共突变、高细胞型/硬化型亚型、甲状腺外扩展（ETE）和LVI与CLNM发生率显著较高相关。LLNM发生率为24.38%（127/521），其高风险因素与CLNM类似。
多因素Logistic回归分析确定，CLNM的独立风险因素包括：男性、年龄<45岁、双侧病灶、LVI和ETE。高危多基因共突变（BRAF与TERT、PIK3CA和/或TP53）是最强的独立预测因子（OR = 6.319, 95% CI: 1.738–22.976, P = 0.005）。LLNM的独立风险因素为：年龄<45岁、双侧病灶、肿瘤大小>1厘米、LVI和ETE。
预测列线图的开发与验证
基于多因素分析结果，研究团队开发了一个整合分子与临床病理特征的预测列线图，用于量化个体发生CLNM的概率。该列线图整合了六个已确定的独立预测因子：性别（以女性为参照）、年龄（以≥45岁为参照）、双侧病灶、高危多基因共突变、LVI和ETE。
内部验证显示，该模型的C-index为0.712（95% CI: 0.668–0.755）。经过1000次Bootstrap抽样校正的校准曲线显示，列线图预测概率与实际观察结果之间具有良好的一致性，表明模型校准满意。
高危共突变在微小PTC中的分层能力
鉴于队列中55.7%（290/521）为微小PTC（肿瘤大小≤1厘米），且考虑到对该类肿瘤采取主动监测的新兴临床模式，研究特别评估了高危多基因共突变在该亚组中的预测价值。
在290例微小PTC患者中，11例（3.8%）携带高危共突变。这些高危微小PTC的CLNM率为81.8%（9/11），显著高于无共突变的微小PTC的CLNM率（46.2%, 129/279）。这相当于CLNM的 odds 增加了5倍以上（OR = 5.23, 95% CI: 1.21 - 22.66; P = 0.027）。该亚组分析证实，高危共突变即使在微小PTC内部也是生物学侵袭性的有力判别指标，突出了其在主动监测决策背景下进行风险分层的潜在临床效用。
多淋巴结转移（>5个）的风险因素
LNM总发生率为60.46%（315/521），其中71.43%（225/315）转移淋巴结数为1-5个，28.57%（90/315）>5个。多因素分析确定，肿瘤大小>1厘米、双侧病灶和肉眼可见的甲状腺外扩展（Gross ETE）是多淋巴结转移（>5个）的独立风险因素。
讨论
主要发现总结
本研究通过整合NGS数据与详细的临床病理特征，建立了一个用于术前预测PTC淋巴结转移（LNM）的综合风险模型。分析明确确定，高危多基因共突变（BRAF与TERT、PIK3CA或TP53）是中央区LNM（CLNM）最强大的独立预测因子。此外，男性、年龄<45岁、双侧病灶、ETE和LVI也被确定为CLNM的重要风险因素。
多基因共突变的核心作用与机制见解
本研究的一个关键发现是，多基因共突变在预测PTC侵袭行为方面优于单纯的BRAF V600E突变。这与该领域不断发展的观点一致。这种强关联（尤其是与CLNM）的机制基础在于关键通路被破坏的协同相互作用：BRAF V600E驱动MAPK通路持续激活，促进增殖和存活；TERT启动子突变维持端粒长度，赋予细胞永生性，这对转移克隆的持续存在至关重要；PIK3CA突变激活PI3K-AKT通路，与MAPK信号协同增强侵袭行为和环境适应；TP53失活则损害细胞凋亡，使具有增殖优势的细胞逃逸死亡。当这些改变共同发生时，它们建立了一个多通路网络，共同增强了转移能力。MAPK与PI3K-AKT通路之间的交叉对话，加上TERT介导的端粒维持和TP53相关的凋亡逃逸，创造了一个高度允许淋巴结侵袭和定植的分子环境。
与既往研究的比较及潜在差异考量
本研究结果与日益增长的共识高度一致，即多基因共突变，特别是涉及BRAF、TERT、PIK3CA和TP53的共突变，标志着PTC中一个高度侵袭性的亚群。与一些西方人群（如TCGA队列）的报告相比，本队列中这些共突变的流行率和特定预测值可能存在某些差异，这可能源于种族因素、样本选择标准或分子谱分析技术的差异。
临床病理因素的补充价值与临床意义
尽管分子标志物具有强大的预测能力，传统的临床病理因素对于风险评估仍然不可或缺，并可作为分子指标的补充。本研究证实，肉眼可见的ETE（Gross ETE）是LLNM和多淋巴结转移（>5个）最重要的风险因素之一，凸显了局部侵袭能力在转移中的关键作用。此外，肿瘤大小>1厘米和双侧病灶也被确定为LLNM和多淋巴结转移的独立预测因子。
这些发现表明，一个全面的术前风险评估系统应整合分子特征和解剖学/临床特征。为实现这一整合方法，本研究开发的列线图为临床医生个体化手术规划提供了实用工具。该模型有助于更精确地识别可能从预防性中央区甚至侧颈区淋巴结清扫中获益的高危患者。
向临床实践的转化
高危共突变的强大预测价值对于优化微小PTC（≤1厘米）的管理具有特别的临床前景。亚组分析显示，在微小PTC中，携带高危共突变的肿瘤其CLNM率高达81.8%，风险增加了五倍以上。在主动监测可作为微小PTC选项的当代，该分子特征为识别其中一小部分但具有固有侵袭潜能的肿瘤提供了有力工具。
因此，将我们的模型整合到临床实践中，能够实现更个性化、分子信息指导的手术策略。我们提出以下临床路径：对术前细针穿刺（FNA）样本进行NGS检测。如果识别出高危多基因谱，则即使中央区淋巴结影像学表现不明确，也为进行彻底的中央区清扫提供了令人信服的理由。关键在于，该分子信号主要与中央区相关。在没有影像学证据的情况下，它并不能成为进行预防性侧颈清扫的理由。侧颈区的处理必须严格由术前超声（±CT）和术中评估决定。
研究局限性与未来展望
本研究存在若干局限性。首先，作为一项基于存档组织的回顾性研究，我们缺乏关于潜在环境风险因素和生活方式因素的系统性数据。其次，研究的统计效能受到样本量的限制，特别是对于罕见的高阶多基因相互作用分析。第三，虽然进行了Bootstrap内部验证，但模型缺乏在独立队列中的外部验证。第四，研究缺乏临床随访数据，因此无法分析与长期结局（如复发或生存）的关联。
展望未来，需要进行大规模、多中心、前瞻性并带有长期随访的研究，以外部验证此风险分层策略。未来的工作还应将NGS分子分型与高分辨率成像和人工智能相结合，以开发更强大、可视化的术前预测工具。最终目标是推动PTC管理进入一个优化肿瘤控制同时最小化不必要并发症的新范式。
