《Frontiers in Plant Science》：Using transcriptome analysis to evaluate the impact of dsAllim cotton on non-target organism O. similis
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本文通过食物链传递和动物饲喂实验，结合转录组分析系统评估了表达昆虫双链RNA（dsRNA）的转基因棉花（dsAllim棉花）对棉田优势捕食性天敌东亚小花蝽（Orius similis）的潜在非靶标效应。研究发现，dsAllim棉花在个体发育和转录组水平上均未对O. similis产生显著不良影响，表明其对这类有益昆虫具有潜在安全性。研究结果为RNA干扰（RNAi）作物的个案化安全评估及监管框架的完善提供了重要参考。
引言
转基因作物在害虫治理中的应用引发了生物安全问题，尤其是基于RNA干扰（RNAi）、表达杀虫双链RNA（dsRNA）的作物。这些作物可能对非靶标生物构成风险，包括害虫的有益天敌。昆虫天敌是全球生物多样性的重要组成部分，在农业生态系统中发挥着关键作用。本研究旨在解决与表达dsRNA的抗虫转基因作物相关的生物安全问题，重点关注其对非靶标生物（特别是天敌）的潜在意外影响。
材料与方法
研究结合生物学和生物信息学方法，利用食物链传递和动物饲喂系统，全面评估了dsAllim棉花表达的外源杀虫dsRNA对棉田捕食性天敌东亚小花蝽（O. similis）生物学参数和转录组的潜在意外影响。使用的dsAllim棉花品系对盲蝽（Apolygus lucorum）具有高抗性。通过食物链实验（让O. similis取食在转基因或非转基因棉花上饲养的蚜虫）和动物饲喂实验（在人工饲料中添加高剂量dsRNA，浓度为棉花叶片中表达量的100倍，即440 ng/g），评估了对O. similis生命表参数的影响。通过定量实时PCR（qRT-PCR）检测dsRNA摄取效率和基因沉默效果。利用RNA测序（RNA-Seq）进行转录组分析，筛选差异表达基因（DEGs），并进行KEGG通路和GO富集分析。通过计算香农熵评估转录组稳定性，并分析脱靶效应与连续匹配碱基对数量的相关性。
结果
O. similis存在田间暴露于dsAllim的风险
蚜虫取食dsAllim棉花叶片48小时后，体内dsAllim含量为（29.0 ± 1.4） × 10–2ng g-1。O. similis取食这些蚜虫后，体内检测到dsAllim含量为14.0 ± 1.6 × 10–4ng g-1，表明O. similis在田间有较高概率通过间接途径暴露于dsAllim。
食物链传递系统未影响O. similis的生命表参数
与对照相比，取食在dsAllim棉花上饲养的蚜虫的O. similis，其若虫存活率、各龄若虫发育历期、性比、羽化率、成虫产卵量及卵孵化率均无显著差异。这表明dsAllim棉花对O. similis的生存和发育没有不良影响。
高剂量dsAllim在动物饲喂试验中未影响O. similis的生命表参数
即使在饲喂试验中应用高剂量（440 ng/g）的dsAllim，其处理组与dsGFP（阴性对照）及ddH2O对照组相比，O. similis的4龄和5龄若虫发育历期、若虫存活率（dsOslim处理组除外）、成虫产卵量、卵孵化率和性比均无显著变化。而作为阳性对照的dsOslim处理则导致若虫存活率显著下降和蛹期死亡率升高。这进一步表明dsAllim棉花对O. similis的生存和发育无不良影响。
dsRNA在O. similis中的摄取效率
饲喂3天后，各dsRNA处理组（dsAllim, dsOslim, dsGFP）的O. similis若虫和成虫体内Oslim基因表达均无显著变化。但饲喂6天（若虫）和7天（成虫）后，dsOslim处理组能显著沉默Oslim基因表达，而dsAllim和dsGFP处理组则无此效应。这证实了dsOslim在动物饲喂试验中的有效性，也解释了dsOslim处理组出现死亡率的原因。
dsAllim在O. similis中诱导了对非同源基因的脱靶效应
对饲喂dsAllim和dsGFP 7天（若虫）及8天（成虫）的O. similis样本进行转录组测序。结果显示，与dsGFP相比，暴露于dsAllim导致若虫中有103个基因下调，成虫中有90个基因下调，但这些差异表达基因并非Oslim基因家族成员。随机选择的19个DEGs的qRT-PCR验证结果与转录组数据一致。
连续匹配碱基对数量与其表达变化倍数的相关性分析表明，表达变化最高的基因通常具有较少的连续匹配碱基对，表明匹配数量与表达变化之间的因果关系多样。dsAllim处理组的若虫和成虫的香农熵值均未发生显著变化，表明dsAllim对O. similis的转录组稳态没有不良影响。
KEGG和GO富集分析显示，dsAllim处理的若虫其DEGs在与肌肉发育相关的KEGG通路中未显著富集，但在与表皮发育、蜕皮周期和角质层发育相关的GO条目中显著富集。成虫的DEGs则在粘着斑KEGG通路中富集，但未在与肌肉发育相关的GO条目中富集。这些结果表明dsAllim在O. similis中诱导了脱靶效应。
脱靶效应与转录组稳态评估
对DEGs的分类分析表明：1）在O. similis转录组中鉴定出的8个Allim同源基因，其表达均未受dsAllim显著影响；2）外源dsAllim对O. similis中相关KEGG通路基因（可达若虫的40%，成虫的30%）有明显影响，即使未影响同源基因表达；3）脱靶效应与连续匹配碱基对数量无关，大多数DEGs的连续匹配碱基对少于10个，且96.43% ~ 100%的含有与dsAllim连续匹配区域的O. similis基因未受影响。香农熵分析证实dsAllim未破坏O. similis的转录组稳态。
讨论
RNAi作物的潜在环境风险仍需深入研究，中国尚未建立标准化的RNAi作物环境风险评估框架。本研究建立的风险评估框架结合了食物链传递测试、高剂量动物饲喂测试、脱靶效应分析和转录组稳态评估。结果表明dsAllim棉花对O. similis安全，这与一些针对其他害虫的dsRNA对其天敌无害的研究结果一致，但也存在dsRNA对某些天敌产生负面影响的报道，因此RNAi作物对天敌的安全性需个案评估。转录组分析揭示了dsAllim在O. similis中诱导了脱靶效应，且这些效应与连续匹配碱基对数量无明确相关性，提示转录组的意外调控在RNAi作物安全评价中不容忽视。然而，香农熵分析表明这些转录组变化并未破坏整体稳态。
结论
研究提出了一个针对昆虫天敌的RNAi作物风险评估框架，包括食物链传递测试、暴露途径评估、动物饲喂测试、脱靶效应分析和转录组稳定性判断。本研究证实dsAllim棉花在个体发育和转录组水平上均对O. similis无不良影响。研究结果强调了对RNAi作物进行非靶标生物安全评估时应采取个案研究的原则，特别是脱靶效应分析，这需要进一步研究以揭示RNAi脱靶的潜在机制。
