微生物-酶协同发酵通过调控酶活性和微生物群落结构增强烟梗细胞壁降解

《Frontiers in Bioengineering and Biotechnology》：Microbe-enzyme synergistic fermentation enhances tobacco stem cell wall degradation by modulating enzymatic activity and microbial community structure

本文提出并验证了一种创新的“微生物-酶协同”（microbe-enzyme synergy）策略，通过将多功能降解菌巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）与其自身胞外酶结合，显著提升了高木质素烟梗细胞壁（主要成分为纤维素、木质素和果胶）的降解效率。研究设计了微生物单独（Tb）、酶单独（Te）和微生物-酶组合（Tb&e）处理，发现Tb&e处理在7天发酵后降解效果最优（纤维素64.93%，木质素57.89%，果胶37.20%），并伴随最高的纤维素酶（cellulase）、漆酶（laccase）和果胶酶（pectinase）活性。高通量测序揭示Tb&e特异性富集了功能菌株巨大芽孢杆菌（相对丰度94.97%），同时抑制了非功能性竞争者（如Acinetobacter johnsonii）。研究阐明了协同作用的正反馈循环机制：初始酶解促进微生物定殖，进而驱动持续的酶生产。该研究为高效生物降解提供了机理模型，并为高木质素农业废弃物的高值化利用提供了创新策略。

　　

引言

植物细胞壁是由木质素（lignin）、纤维素（cellulose）和果胶（pectin）构成的复杂网络结构，其中木质素形成的交联芳香基质包裹并保护着多糖，构成了生物降解的主要屏障。传统的单一微生物或酶制剂策略在降解此类复杂生物质时面临效率低、稳定性差、对富木质素底物效果不佳等显著局限。微生物-酶协同方法整合了酶的直接水解作用和微生物的适应性、持续产酶能力，有望提升降解效率。巨大芽孢杆菌因其具备降解纤维素、果胶和木质素的广谱酶系而成为该协同策略的理想候选者。本研究创新性地采用“自身协同”系统，将巨大芽孢杆菌与其自身胞外酶结合，旨在验证该协同作用能否显著增强烟梗细胞壁的降解，并阐明其内在机制。

材料与方法

研究菌株来自河南农业大学，保藏于中国典型培养物保藏中心。实验设计了四个处理组：以无菌水为对照（CK）、仅酶处理（T_e）、仅微生物处理（T_b）以及微生物-酶组合处理（T_b&e）。烟梗与处理液按0.25 mL/g的比例在30°C、65%湿度下发酵7天。发酵结束后，测定细胞壁组分（纤维素、木质素、果胶）含量、关键酶（纤维素酶、漆酶、果胶酶）活性，并利用Illumina MiSeq平台对微生物群落V3-V4区进行高通量测序，通过PCoA、LEfSe和Spearman相关性分析群落结构和功能关联。

结果

3.1 不同处理对酶活性和细胞壁组分含量的影响

T_b&e处理展现出最显著的细胞壁降解效果：纤维素、木质素和果胶含量分别比CK组降低了64.93%、57.89%和37.20%，显著优于T_b和T_e单独处理。相应地，T_b&e组的纤维素酶、漆酶和果胶酶活性也均为最高，表明协同作用有效提升了关键降解酶的催化能力。

3.2 不同处理对微生物多样性的影响

Alpha多样性分析显示，T_b&e组的Shannon指数显著低于其他组，表明其群落多样性降低。PCoA分析表明，各处理组（尤其是T_b&e）的微生物群落结构与CK组显著分离。群落组成分析发现，T_b&e组中芽孢杆菌属（Bacillus，其优势OTU注释为巨大芽孢杆菌）的相对丰度高达94.97%，而仅在T_b组中占优势的约翰逊不动杆菌（Acinetobacter johnsonii）在T_b&e组中被抑制至不足1%。这表明微生物-酶协同处理能够特异性富集功能微生物，并塑造有利于降解的功能性群落结构。

3.3 微生物功能预测

基于PICRUSt2的功能预测显示，与CK组相比，各处理组（尤其是T_b&e组）的微生物群落其功能潜力在细胞壁水解、碳代谢、碳氮键裂解酶以及跨膜转运等相关模块上显著富集。这提示协同处理不仅改变了群落组成，更上调了与细胞壁降解和营养吸收相关的代谢通路。

3.4 微生物丰度与细胞壁物质含量的相关性分析

Spearman相关性分析进一步证实，芽孢杆菌属（巨大芽孢杆菌）的丰度与纤维素和木质素含量呈显著负相关，而约翰逊不动杆菌等菌属的丰度则与多种细胞壁组分呈正相关。这明确了巨大芽孢杆菌是驱动细胞壁降解的核心功能微生物。

讨论

本研究成功证实了微生物-酶自身协同策略在降解高木质素烟梗方面的卓越效果。其协同机制可概括为一个多阶段的正反馈循环：初始阶段，外源酶对细胞壁结构进行“启动”攻击，破坏物理屏障；随后，释放的小分子物质促进巨大芽孢杆菌的快速定殖和扩增；接着，大量繁殖的功能菌进行持续的原位酶合成与分泌，推动深度降解；最终，改变的营养环境选择性富集功能菌并抑制竞争者，从而“工程化”塑造出一个高效的降解群落。与以往研究相比，本研究采用单一多功能菌株的“自身协同”模型，简化了系统复杂性，为阐明核心协同原理提供了清晰的框架，并在高木质素底物上取得了显著成效。尽管本研究在非无菌条件下进行，但内部证据强有力地支持了处理效应（尤其是T_b&e的协同效应）的主导作用。未来研究可采用灭菌底物、结合代谢组学或宏基因组学等技术，进一步精确解析碳流命运和功能基因表达。

结论

本研究系统阐明了巨大芽孢杆菌-酶协同发酵在促进烟梗细胞壁降解中的关键作用及内在机制。该策略通过增强酶活性、重塑微生物群落结构（特异性富集功能菌）以及上调相关代谢功能，实现了对纤维素、木质素和果胶的高效协同降解。研究成果为高木质素农业废弃物（如烟梗）的高值化利用（如转化为饲料、生物燃料原料或有机肥）提供了理论基础和技术支持，并展示了一种可应用于其他难降解生物质的通用性策略框架。未来的研究重点可放在降解产物的精确追踪以及通过宏基因组或宏转录组学直接验证关键功能基因的表达上。