《Frontiers in Microbiomes》：Community assembly following disturbance in batch anaerobic digesters displays highly reproducible secondary succession and a shifting stochastic-deterministic balance
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本文通过宏基因组学与生态模型，揭示了预适应厌氧消化微生物群落在经历高强度扰动（如高进料-接种比与外来物种入侵）后，其二次演替过程展现出高度的可重复性，且群落组装机制从早期演替的随机过程主导，逐渐转变为晚期演替的确定性选择主导，这一发现为理解工程微生物生态系统的稳定性和功能恢复提供了重要理论依据。
1 引言
微生物群落组装的驱动和控制因素已成为微生物生态学的主要研究主题，这对于工程微生物组尤为重要，因为其功能依赖于群落结构。群落组装是微生物物种从区域物种库迁移到局部环境并相互作用形成局部群落的生态过程。该过程可发生在未定殖环境或已建立微生物群遭受扰动后，分别代表初级演替和二次演替。演替路径涉及随机性（如生态漂变和扩散）和确定性（如选择）机制。四类生态过程反映了随机-确定性平衡的转变：同质化选择、可变选择、均质化扩散和扩散限制。二次演替由生物或非生物事件引起的扰动触发，可能推动群落沿不同路径发展，形成替代状态。在工程微生物组中，演替路径受接种物多样性、胁迫因子和随机过程影响。
厌氧消化(AD)是一种处理高浓度有机废物的过程，依赖细菌和古菌群落的协作，通过多营养级食物网将有机物转化为甲烷。消化器的启动和运行均可能发生演替。启动阶段的高底物-接种物(S/I)比可能导致酸化和非产甲烷群落组装。同时，废弃物进料携带大量外来物种，可能干扰群落结构。长期稳定运行的消化器表现出物种持久性，表明存在生态位特化、竞争排斥和稳定性。
批式消化器作为封闭系统，是研究二次演替中群落组装的理想模型。其群落依赖内源碳和能量，经历资源耗竭和代谢物积累的方向性变化。液体环境可能削弱扩散作用，但复杂颗粒有机物的分解可能增加环境异质性，从而改变随机-确定性平衡。使用预适应消化器的接种物，其物种已经历筛选和生态位分配，因此批式消化器适合研究二次演替中的群落组装机制。
本研究旨在评估批式消化器在可能产生替代演替状态的扰动后，群落组装过程的可重复性。若确定性过程主导，复制群落应具有高度相似结构；若随机性和历史偶然性作用显著，则可能导致替代演替路径。通过宏基因组学，探究物种和功能多样性是否受确定性或随机性过程影响。
2 材料与方法
实验设计采用三个复制批式消化器，接种物来自长期运行（1283天）并预适应禽粪底物的连续搅拌釜式反应器(CSTR)。进料与接种物体积比异常高（19:1），远高于推荐启动比例（2-4:1），增加了由进料微生物多样性和高稀释度扰动引起的随机性周转机会。消化器在37±2°C下运行191天，底物为3%总固体(TS)的禽粪浆液。定期监测甲烷、乙酸、丙酸、丁酸、pH、氨氮(N-NH3)和化学需氧量(COD)等理化参数。
在三个性能阶段（P1：启动与甲烷抑制；P2：高产甲烷；P3：低甲烷平台期）采集样品进行宏基因组测序。DNA提取后使用Illumina Hiseq平台进行测序，数据提交至NCBI BioProject PRJNA1327443。使用MG-RAST进行系统发育和功能注释，STAMP和R软件进行统计分析。通过β最近类群指数(βNTI)和Raup-Crick Bray-Curtis(RCbray)分析评估随机性和确定性过程的相对贡献。
3 结果
3.1 沿演替梯度的复制消化器平行性能
所有理化参数在三个阶段间均存在显著差异(p<0.05)，表明各演替阶段具有不同的过程条件和微生物活性。P1阶段甲烷产量低，表明禽粪进料稀释引起抑制；P2阶段总沼气和甲烷百分比达到峰值（甲烷百分比63.7–73.2%）；P3阶段甲烷百分比下降至25.2–34.8%。COD呈明显下降趋势(P1>P2>P3，p<0.001)，反映有机物逐步降解。丙酸浓度在P1最高，P3显著降低(p<0.001)，表明互养氧化增强和产甲烷条件改善。乙酸在P2最高(p=0.018)，丁酸在P3显著低于P2(p=0.048)。pH从P1到P3逐步升高(p<0.01)，与挥发性脂肪酸消耗和蛋白质分解释放氨一致。氨氮(N-NH3)浓度在P3显著高于P1(p=0.003)，表明后期脱氨活性增强。主成分分析(PCA)显示各阶段明显分离（除D3的P2），主成分1和2分别解释75.2%和14.9%的变异。
3.2 复制消化器中群落结构的演替
宏基因组分析显示，可分类序列中细菌相对丰度为96.1–99.01%，古菌为0.5–3.38%。总物种库存近相同（D1:1602种，D2:1611种，D3:1601种），95%物种在所有样品中共享。多元分析表明消化器身份对群落结构无显著影响(ANOSIM R=–0.1605, p=0.7565; PERMANOVA F=0.188, p=0.8177)，而阶段效应显著(ANOSIM R=0.8025, p=0.0033; PERMANOVA F=18.136, p=0.0033)。P1阶段优势菌科为乳杆菌科(Lactobacillaceae)、肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、棒状杆菌科(Corynebacteriaceae)和芽孢杆菌科(Bacillaceae)；P2阶段优势菌科包括互养菌科(Synergistaceae)、互养单胞菌科(Syntrophomonadaceae)、真杆菌科(Eubacteriaceae)等；P3阶段优势菌科转向拟杆菌科(Bacteroidaceae)、紫单胞菌科(Porphyromonadaceae)、热袍菌科(Thermotogaceae)等。聚类分析显示，高丰度和低丰度物种均呈现可重复的演替动态，D1和D2在各阶段相似度最高，D3在P2和P3阶段呈现一定差异。
βNTI分析显示，P2到P3的转变被归类为确定性过程（|βNTI|=2.60），表现为可变选择；P1到P2的转变接近零，表明随机过程贡献更大，属于非主导过程；P1到P3的转变表现为扩散限制。这表明在演替过程中，群落组装机制从随机性向确定性转变。
3.3 复制消化器中群落功能的演替
总功能在P1与P2间相关性较低(R2=0.814)，P2与P3间高度相似(R2=0.983)。能量功能和碳水化合物功能也呈现相同模式：P1/P2相关性较低（能量R2=0.630，碳水化合物R2=0.697），P2/P3相关性高（能量R2=0.978，碳水化合物R2=0.969）。特定功能在各阶段出现峰值：P1阶段富集氮代谢、脂肪酸代谢、丙酮酸代谢、丙酸代谢、磷酸转移酶系统(PTS)和多环芳烃(PAH)代谢等功能；P2阶段富集乙酸代谢（乙酸激酶ackA和磷酸转乙酰酶pta基因）、丁酸代谢、氨酰tRNA合成酶、核糖体和碳固定等功能；P3阶段富集TCA循环、糖苷降解和半乳糖/果糖/甘露糖代谢等功能。聚类分析显示，D1和D2在能量和碳水化合物功能上轨迹相似，D3在P3阶段碳水化合物功能相似性降低。
4 讨论
研究证实，当预适应产甲烷微生物群遭受解体（稀释）并置于具有资源梯度和大量外来物种的相似环境中时，批式消化器启动表现出群落结构和功能的高度可重复组装路径。三个复制体系均沿资源梯度呈现方向性变化，该梯度由微生物代谢与资源质和量的反馈作用形成。高度可重复的二次演替阶段对应三个消化器性能阶段：甲烷抑制、高产甲烷和低甲烷平台期。每个阶段以特定物种和菌科的丰度峰值为特征，能量和碳水化合物代谢及细胞生理功能也呈现演替动态。约1600个物种的组成和功能在演替过程中的变化在消化器间惊人相似。随机性和确定性过程的平衡沿演替梯度发生转变。
4.1 沿资源梯度的二次演替阶段
已知产甲烷食物网包括水解、酸生成、乙酸生成和产甲烷步骤。阶段1（早期演替）中，产甲烷群落的严重稀释破坏种间互作，甲烷和沼气产量暂时抑制，但产甲烷作用较快恢复，表明互作恢复。易降解底物（糖类、氨基酸）首先被水解和发酵，磷酸转移酶系统(PTS)和丙酸途径基因出现峰值支持这一推断。阶段2（中期演替）以沼气产量峰值和群落结构及功能的显著变化为特征。资源梯度随总有机碳大幅下降和食物网中间体（乙酸、CO2）增加而变化，反映于能量和碳水化合物代谢的功能转变。强正种间互作和高营养水平支撑最大甲烷产量，乙酸水平、乙酸代谢基因(ackA, pta)和氢营养型产甲烷菌(Methanomicrobiaceae)的峰值提供证据。含互养细菌的菌科（互养菌科、互养单胞菌科和热厌氧杆菌科）在此阶段达到峰值。核糖体和氨酰tRNA生物合成基因的峰值表明细胞生长和扰动环境的再定殖。尽管存在稀释和大量潜在入侵外来物种，但物种（包括稀有物种）在消化器间高度收敛，可能代表预先环境过滤对生态位专家的选择。
阶段3（晚期演替）性能特性收敛度最高，丙酸、丁酸、乙酸、COD和pH水平最为相似。甲烷和沼气产量大幅下降，表明易降解有机物耗尽，丙酸和乙酸水平最低。分解转向顽固有机物（如纤维素），碳水化合物功能中糖苷降解和半乳糖/甘露糖（半纤维素组分）代谢出现峰值。TCA循环基因增加而丙酮酸代谢基因减少，表明从发酵向呼吸转变。尽管高游离氨可能抑制产甲烷菌，但本研究中的氨水平与甲烷产量增加一致，表明抑制最小或氨耐受产甲烷种群活跃。峰值菌科包括热袍菌科、紫单胞菌科和拟杆菌科，它们产生用于水解以及纤维素和半纤维素等多糖分解的酶。由于甲烷和乙酸大幅减少，推测强互养互作减弱，与互养菌科减少一致。
4.2 随机性、确定性和偶然性
证据表明二次演替过程中随机性和确定性机制平衡发生转变。基于Stegen等人的概念体系，阶段1到2的转变可归类为非主导过程，扩散和选择均非最主要，可能由于接种物和液体进料的初始混合在反应器中产生随机扩散，随后产甲烷食物网重组时群落收敛。相反，阶段2到3的转变归类为确定性过程，表现为可变选择。推测可变选择代表环境异质性增加，即使消化器为液体环境，也可能是由于底物中植物生物量和颗粒有机物的缓慢、不规则分解所致。
阶段2–3转变中确定性选择增加与稀有物种和碳水化合物功能的分化相关。推测这些稀有物种是顽固复杂有机物的专业降解者，利用碳水化合物活性酶(CAZymes)。这与分解过程中碎屑生物质异质性增加的预期一致。Yu等人也发现，当物种共享主要资源时，具有特殊功能的物种可以共存。这些因素可能解释拟杆菌门（专业多糖降解者）在易降解底物（如糖类）初始消耗时丰度收敛，而在晚期演替时分化的现象。此外，颗粒物质在长期消化过程中可能逐步被定殖，进一步增加环境变异性。稀有物种分化的其他可能原因包括同一物种在不同背景下动态不同，或物种互作（互惠 versus 竞争）随营养变化而改变。因此，提出最高程度的确定性与可变选择相关，即稀有物种响应异质性资源质量和空间复杂性。
其他消化器研究也表明确定性组装的存在。例如，Vanwonterghem等人发现在复制CSTR消化器中群落演替高度平行。但该研究与其他研究使用显著不同的实验条件，特别是合成进料。Huber等人在处理禽粪的胁迫嗜热消化器中发现，性能恢复与特定种群恢复而非冗余物种替代同时发生，表明生态位特化。本研究中母体消化器接收禽粪进料超过三年，可能促进互惠互作发展。稀有物种的收敛也暗示协同网络的发展。先前对本消化器的研究显示演替过程中网络组织和模块性发生变化，可能表明生态位专家和互惠主义存在。还发现组装机制存在时间尺度依赖性。当比较早期演替(P1)和晚期演替(P3)时，表现为扩散限制，可能由于反应器封闭性，无法从区域物种库迁入新物种。这表明采样演替梯度的时间尺度对于辨别组装过程非常重要。
研究还发现历史偶然性对演替路径影响的初步证据。尽管所有三个消化器存在相似演替阶段，但物种和功能可区分为两条路径（D1/D2和D3），即使物种组相同。对于优势种和稀有物种以及功能，初始相似度最高的两个消化器(D1, D2)显示最相似的演替路径。相反，D3相似度较低，甲烷产量延迟。D3在阶段1的差异无疑由抽样效应引起。即使三个消化器通过均分接种物-进料混合物启动，D3显示种群初始变异最大。Pascual-Garcia等人发现群落组成的微小差异可能导致不同演替轨迹。本研究中，在D1/D2中期和晚期演替中成为优势的多数细菌和产甲烷菌，在D3中初始丰度较低且从未达到相似水平。例如，与植物生物质降解相关的物种（解纤维梭菌Clostridium cellulolyticum、植发酵梭菌C. phytofermentans、热纤梭菌C. thermocellum）在D3中增加缓慢。但需注意，聚类是描述性统计，需要进一步确认，理想情况下需增加复制反应器，但鉴于实验规模和经济成本不可行。
4.3 局限性与应用
本研究存在若干局限性和应用点。重要一点是遭受扰动的消化器微生物群落已经过长期选择预组装，为竞争排斥和来自进料 metacommunity 的入侵提供了先机。完全不同的进料是否会产生高度可重复的演替是相关问题。补充实验可使用含新外来物种的另一进料，评估是否出现不同替代演替路径。进一步推测晚期演替中环境异质性由于有机物逐步分解和定殖而增加，该假设可通过随时间分离有机颗粒物并测量多样性来检验。替代瞬态状态是否是AD的重要特征值得进一步审视。事实上，厌氧消化的一个优势是微生物组对操作变化的适应性，表明操作群落状态存在显著广度；然而，正常运行偶尔会无明显原因地滑向功能障碍。在工业应用方面，本研究有助于定义“微生物组设计原则”，其中控制生物反应器群落组装是生态工程方法的基本目标。这些发现如何转化至稳态消化器仍有待检验。可能非主导的群落组装机制随每次新鲜进料脉冲递归出现。更深入理解厌氧消化中的群落组装过程可能有助于设计恢复力、产品质量和新应用。
