《Frontiers in Microbiology》：Tailored phage cocktail with resistance management for controlling Dickeya solani in potatoes
编辑推荐：
本文报道了一种针对马铃薯软腐病主要致病菌Dickeya solani（D. solani）的定制噬菌体鸡尾酒疗法。研究通过序贯分离策略获得三株裂解性噬菌体（LMST、PDS1、PDS2），它们均缺乏溶原性、毒力或抗生素抗性基因，安全性良好。该鸡尾酒能更有效抑制细菌生长，并将马铃薯块茎病害严重程度降低68.75%（预防）和59%（治疗），同时显著延缓噬菌体抗性菌株的出现，为植物病害的绿色防控提供了新策略。
1 引言
马铃薯（Solanum tuberosum）是全球重要的粮食作物，但其生产面临软腐病等细菌性病害的严重威胁。其中，Dickeya solani（D. solani）被认为是攻击性最强的软腐果胶杆菌科（SRP）成员之一，在全球范围内造成重大经济损失。目前缺乏对该病原菌具有抗性的商业化马铃薯品种，也缺乏有效的环境友好型化学防治措施。噬菌体作为能够特异性感染并裂解细菌的病毒，具有宿主特异性高、可自我复制、环境友好等特点，在植物病害生物防治方面展现出巨大潜力。然而，细菌快速产生噬菌体抗性是其应用的主要障碍。本研究旨在开发一种具有抗性管理功能的定制噬菌体鸡尾酒，以有效控制马铃薯中的D. solani。
2 材料与方法
2.1 细菌菌株和培养条件
本研究使用来自法国植物病原细菌保藏中心（CFBP）的D. solani菌株CFBP 7373。所有菌株在28°C下于YPG液体培养基或YPGA固体培养基上培养。
2.2 Dickeya solani新兴抗性菌株靶向噬菌体的逐步分离
从摩洛哥Meknes-Fès地区采集的污水样本中，通过序贯富集和分离策略，依次分离得到三株噬菌体，分别命名为LMST、PDS1和PDS2。具体步骤包括：首先使用D. solani CFBP 7373从第一份水样中分离出LMST；然后利用对LMST产生抗性的D. solani菌株作为宿主，从第二份水样中分离出PDS1；最后，利用对PDS1产生抗性的菌株从第三份水样中分离出PDS2。将三种噬菌体的高滴度裂解液等体积混合，制成噬菌体鸡尾酒用于后续实验。
2.3 透射电子显微镜和元数据分析
通过透射电子显微镜观察噬菌体的形态及其与D. solani的相互作用。结果显示，LMST、PDS1和PDS2均呈现肌尾病毒科A1形态型特征，具有等径头部和可收缩尾部。头部直径分别为85、90和110 nm，尾部长度分别为120、130和140 nm。
2.4 噬菌体DNA提取和全基因组测序
提取三株噬菌体的基因组DNA并进行Illumina HiSeq测序。基因组注释显示，LMST、PDS1和PDS2的基因组大小分别为153,878 bp、254,449 bp和133,665 bp的双链DNA。功能预测和安全性筛查证实三者均缺乏溶原性、毒力或抗生素抗性（AMR）基因，适合作为生防制剂。
2.5 噬菌体裂解活性点样试验
通过点样试验评估噬菌体对不同滴度D. solani的裂解活性。LMST在108至105PFU/mL浓度下均能有效裂解野生型D. solani，而PDS1和PDS2在108和107PFU/mL下显示裂解活性。重要的是，对单一噬菌体产生抗性的菌株，仍能被其他两株噬菌体裂解，显示出互补的宿主范围。
2.6 噬菌体诱导细菌裂解的浊度测定
在液体培养中，与未处理对照相比，所有噬菌体处理在最初24小时内均显著抑制D. solani生长。噬菌体鸡尾酒在所有测试的感染复数下均表现出最强的抑制效果，并能将细菌密度维持在较低水平长达96小时，有效减缓了抗性菌株的出现。
2.7 噬菌体的热稳定性
热稳定性测试表明，三种噬菌体在-20°C至60°C的广泛温度范围内均能保持感染性，在4°C时最稳定。PDS1和PDS2在70°C下仍保留部分活性，显示出良好的热稳定性。
2.8 宿主范围测定
宿主范围分析显示，三种噬菌体均能裂解所有10个测试的D. solani菌株，表现出高度的种内特异性。LMST是唯一一株还能裂解D. fangzhongdai的噬菌体。所有噬菌体对测试的其他植物病原菌或有益菌均无裂解活性。
2.9 定制噬菌体鸡尾酒控制软腐病的离体功效评估
在马铃薯块茎离体实验中，预防性和治疗性施用噬菌体鸡尾酒分别使D. solani引起的症状严重程度降低了68.75%和59%。qPCR分析显示，经鸡尾酒处理的块茎中细菌载量显著低于未处理对照组，分子水平证实了其显著的生物防治效果。
3 结果
3.1 分离噬菌体的形态和裂解潜力
成功分离出三株能裂解D. solani的噬菌体LMST、PDS1和PDS2。TEM确认其为肌尾病毒科形态。点样试验显示它们对野生型D. solani具有裂解活性，且对单一噬菌体产生抗性的菌株对其他噬菌体仍保持敏感性，表明其作用机制的互补性。
3.2 LMST、PDS1和PDS2与Dickeya solani细胞的相互作用
TEM观察揭示了噬菌体吸附、细菌细胞裂解和子代噬菌体释放的多个阶段。值得注意的是，D. solani在受到PDS2攻击时会产生外膜囊泡，这些囊泡能作为诱饵吸附PDS2颗粒，这可能是一种细菌防御机制。
3.3 噬菌体的基因组和系统发育分析
基因组分析表明三株噬菌体均为严格的裂解性噬菌体，无安全性风险。比较基因组学显示，LMST和PDS1分别与已知的Limestonevirus属和Salmondvirus属噬菌体高度相似，而PDS2与任何已知噬菌体均无显著相似性，代表一个新的进化谱系。
3.4 LMST、PDS1和PDS2对Dickeya solani生长的个体和联合抗菌作用
液体培养生长曲线表明，噬菌体鸡尾酒比单一噬菌体处理能更有效地抑制D. solani生长，并显著延缓抗性菌株的出现，显示出协同作用。
3.5 噬菌体的热稳定性
（同2.7）
3.6 宿主范围测定
（同2.8）
3.7 噬菌体鸡尾酒控制软腐病的离体功效
（同2.9）
4 讨论
本研究通过理性的序贯分离策略，成功构建了一种能有效控制D. solani并管理其噬菌体抗性的三组分噬菌体鸡尾酒。该鸡尾酒在离体条件下显著降低了马铃薯软腐病的严重程度和病原菌载量。研究发现D. solani能通过产生外膜囊泡来防御PDS2噬菌体，这为理解细菌-噬菌体相互作用提供了新见解。基因组分析证实了噬菌体的安全性和新颖性，尤其是PDS2代表了一个新的噬菌体谱系。该研究为开发可持续的植物病害生物防治策略提供了重要理论和实践依据，符合绿色农业的发展方向。未来的研究可侧重于探索噬菌体与其它生防制剂的协同作用，以及优化其在实际农业环境中的应用策略。
