《CELL DEATH AND DIFFERENTIATION》：Oncogenic p53 induces mitotic errors in lung cancer cells by recopying DNA replication forks conferring targetable proliferation advantage
编辑推荐：
本研究针对肺癌中常见的p53功能获得性突变如何导致染色体畸变和肿瘤生长依赖性的难题，揭示了致癌性p53通过上调复制因子表达，增加DNA复制起始点激活频率，从而诱发复制应激，导致已复制DNA被重新复制的独特机制。这些重复制中间体在细胞分裂后产生DNA片段，激活ATM信号通路，反过来稳定致癌性p53，形成自我维持的正反馈循环，并最终导致染色体分离错误，选择性促进具有有丝分裂异常的肿瘤细胞增殖。重要的是，研究证明利用Chk1和ATM抑制剂联合干预可特异性诱导致癌性p53肺癌细胞凋亡，为靶向治疗提供了新策略。
在肺癌治疗研究领域，肿瘤抑制蛋白p53的突变一直是一个核心问题。令人困惑的是，虽然野生型p53的缺失会导致基因组不稳定性，但携带特定错义突变的p53蛋白（称为功能获得性p53或致癌性p53）不仅丧失了肿瘤抑制功能，反而获得了促进肿瘤生长的能力。更深入的研究发现，许多肺癌细胞对致癌性p53的存在产生了“上瘾”般的依赖性，去除这些突变体反而会抑制肿瘤生长。然而，一个关键的科学问题悬而未决：致癌性p53究竟通过何种分子机制，诱导染色体畸变，并建立起这种维持肿瘤持续性生长的依赖性？
为了回答这个问题，发表在《CELL DEATH AND DIFFERENTIATION》上的这项研究进行了一系列深入的探索。研究人员发现，致癌性p53扮演了一个“复制加速器”的角色。它通过转录上调一系列复制因子（如Cyclin A、Chk1等），大幅增加了DNA复制起始点（origin）的激活频率。这种过度的“点火”行为虽然加快了基因组复制速度，却也带来了严重的后果——DNA复制应激。
研究团队运用了多种关键技术来揭示这一过程。他们利用DNA纤维伸展技术（DNA fiber spreading）直观地展示了复制叉的进程；通过免疫荧光染色检测复制应激标志物如RPA灶（RPA foci）和53BP1/γH2AX共定位灶；采用活细胞延时成像（live cell imaging）追踪细胞分裂过程中的染色体行为；并借助免疫印迹（immunoblot）分析ATM/Chk2信号通路的激活状态。此外，研究还使用了患者来源的异种移植瘤模型和体外异种移植瘤模型来验证临床相关性，并通过小分子抑制剂（如Chk1抑制剂MK8776、ATM抑制剂KU60019）进行功能干预实验。
Onc-p53 activates markers of DNA replication stress in lung cancer cells
研究首先证实，致癌性p53确实在肺癌细胞中诱发了DNA复制应激。与p53被敲除的细胞相比，表达致癌性p53（如H1975细胞的p53-R273H突变）的细胞，其DNA复制纤维的延伸轨迹更短，相邻复制起始点之间的距离也更短。同时，细胞核内结合单链DNA的复制蛋白A（RPA）形成的焦点数量显著增加，这表明复制叉处存在更多的单链DNA间隙。最关键的是，DNA纤维分析发现，在同一个S期内，致癌性p53诱导了“复制叉重复制”现象，即后续加入的核苷酸类似物（CldU，绿色）会沿着刚刚被复制过的DNA区域（IdU标记，红色）进行再次复制，形成黄色重叠信号。这些证据共同表明，致癌性p53通过增加复制负担，导致了独特的复制应激状态。
Onc-p53 mutants increase co-localized 53BP1/H2AX foci formation in G1 nuclei and activate ATM signaling
那么，这些重复制的DNA结构命运如何？研究发现，这些异常的复制中间体未能被完全解决，随着细胞进入有丝分裂并被传递到子代细胞的G1期细胞核中，形成了共定位的53BP1和γH2AX焦点。这标志着存在DNA双链断裂或片段。更重要的是，这种由内部复制错误产生的持续DNA损伤信号，激活了关键的ATM激酶，表现为ATM第1981位丝氨酸（Ser1981）及其下游靶点Chk2第68位苏氨酸（Thr68）的磷酸化水平升高。
Release of replication stress driven by Onc-p53 reduces the frequency of re-copied replication forks, 53BP1/γH2AX foci formation in G1 nuclei and ATM phosphorylation
为了确认上述现象确实源于致癌性p53驱动的复制应激，研究人员巧妙地利用小干扰RNA（siRNA）部分敲低复制许可因子Cdt1或激酶CDC7，从而降低复制起始频率。结果发现，当复制起始被抑制后，复制叉重复制的事件、G1期核内的53BP1/γH2AX焦点以及ATM的磷酸化水平都随之显著下降。这证明致癌性p53诱导的复制起始过度激活是产生上述一系列效应的根源。
Lung cancer cells with p53 mutation show Onc-p53 dependent genome segregation errors
这些被传递到子代细胞的DNA碎片会带来什么功能性后果？活细胞成像给出了生动的答案。表达致癌性p53的肺癌细胞在分裂过程中，频繁出现染色体滞后、染色质桥、微核以及多核细胞等染色体分离错误。而相比之下，p53被敲除的细胞或携带野生型p53的细胞（如A549），这类错误要少得多。这表明致癌性p53特异性地导致了有丝分裂过程的紊乱。
In contrast to patient-derived lung tumors with WT p53, lung tumors with Onc-p53 show selection of cells with mitotic aberration
这一发现在临床样本中得到了支持。对携带致癌性p53突变（如R158L， R159P）的患者来源肺癌组织进行连续传代分析发现，随着肿瘤的增殖，带有微核和有丝分裂异常的细胞比例显著增加，显示出生长优势。而携带野生型p53的肿瘤则没有这种选择现象。这说明致癌性p53确实在体内环境中促进并筛选了具有基因组不稳定的细胞群体。
Onc-p53 induces ATM signaling and stabilizes itself, in turn upregulating Cyclin A and Chk1 expression establishing a self-sustaining feedforward loop
研究进一步揭示了一个精妙的恶性循环，即“自我强化的正反馈环路”。ATM的激活不仅是对DNA损伤的反应，它还能磷酸化并稳定致癌性p53蛋白本身（如p53第15位丝氨酸磷酸化），延长其半衰期，导致其在癌细胞中大量积累。而更稳定的致癌性p53又进一步上调Cyclin A和Chk1等基因的表达，这反过来又会促进复制起始，产生更多的重复制事件和DNA片段，从而持续激活ATM。这个循环使得致癌性p53的功能和稳定性得以不断自我强化，驱动肿瘤进展。
Release of replication stress induces apoptosis specifically in lung cancer cells with Onc-p53
基于上述机制，研究提出了一个靶向治疗策略：打破这个恶性循环。当使用Chk1抑制剂（MK8776）处理细胞时，它剥夺了癌细胞应对复制应激的关键能力，导致复制叉崩溃。活细胞成像显示，这特异性地诱发了表达致癌性p53的肺癌细胞在进入有丝分裂前发生凋亡。而p53缺失的细胞则只是经历细胞周期延迟，并未大量死亡。这表明致癌性p53癌细胞对其自身诱导的复制应激状态存在独特的依赖性。
Small molecule inhibitors of ATM or its downstream target Chk2 cooperate with Chk1 inhibitors to specifically inhibit growth of cultured lung cancer cells or xenograft tumors with Onc-p53 inducing apoptosis
最终，研究人员在体外细胞培养和体内小鼠肿瘤模型（皮下移植瘤和肺原位移植瘤）中验证了联合靶向治疗的潜力。结果显示，Chk1抑制剂与ATM抑制剂（或Chk2抑制剂）联合使用，能够协同抑制致癌性p53肺癌细胞的增殖和肿瘤生长，并诱导显著的凋亡（TUNEL染色和cleaved caspase-3阳性细胞增加）。而对p53缺失或野生型p53的肿瘤细胞影响很小。这种联合疗法甚至能几乎完全清除肺原位模型中的致癌性p53阳性肿瘤细胞。
综上所述，本研究阐明了致癌性p53在肺癌中驱动基因组不稳定性和肿瘤依赖性的一个核心机制：它通过过度激活DNA复制起始，诱导产生重复制的DNA中间体，这些中间体在细胞分裂后形成DNA片段，持续激活ATM信号。ATM信号反过来磷酸化并稳定致癌性p53，形成一个自我维持的正反馈循环，从而促进并筛选具有有丝分裂错误的细胞群体，赋予其增殖优势。这一发现的意义在于，它不仅深化了对p53功能获得性突变致癌机理的理解，更重要的是，揭示了癌细胞的一个致命弱点——其对自身诱导的复制应激的依赖性。研究证明，利用Chk1和ATM/Chk2抑制剂联合干预，可以有效地特异性靶向这一弱点，为治疗携带p53突变的肺癌提供了极具前景的新策略。
