《Applied Microbiology and Biotechnology》：An improved CRISPR-Cas9 protein-based method for knocking out insect Sf9 cell genes
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【编辑推荐】为克服昆虫细胞在生物制药应用中凋亡早、工具少的瓶颈，本研究开发了高效的CRISPR-Cas9 RNP递送策略。通过敲除Sf-Dronc基因，成功获得抗凋亡能力增强的Sf9细胞株，使流感病毒样颗粒（iVLPS）产量提升超两倍，为昆虫细胞平台工艺优化提供新范式。
在生物制药行业蓬勃发展的今天，昆虫细胞表达系统因其高效的蛋白质翻译后修饰能力，逐渐成为疫苗和基因治疗载体生产的重要平台。然而，与成熟的哺乳动物细胞平台相比，昆虫细胞系的开发一直面临两大挑战：一是缺乏成熟的基因工程工具，二是基因组特征研究不够深入。特别是在利用杆状病毒表达系统进行大规模生产时，病毒感染会过早触发细胞凋亡，导致产品产量大幅降低，成为制约产业化的关键瓶颈。
传统基因编辑技术在昆虫细胞中应用效果有限，效率低下成为制约其发展的主要障碍。CRISPR-Cas9技术虽然在其他生物体系中展现出强大潜力，但在昆虫细胞中的应用却鲜有报道。面对这一困境，研究人员将目光投向了更具创新性的方法——核糖核蛋白复合物（Ribonucleoprotein, RNP）递送策略，试图通过直接递送预组装的Cas9蛋白与引导RNA（guide RNA）复合物，实现对昆虫细胞基因组的精准编辑。
该研究以《Applied Microbiology and Biotechnology》为发表平台，聚焦于解决昆虫Sf9细胞在生物制药生产中的实际问题。研究人员设计并优化了一套完整的基因编辑流程，专门用于向Sf9细胞递送CRISPR-Cas9 RNP复合物。这一创新策略的核心优势在于：RNP复合物在细胞内的存在时间短暂，可显著降低脱靶效应，同时编辑效率更高。
研究团队将这一技术应用于一个关键靶点——Sf-Dronc基因。该基因是昆虫细胞中凋亡起始的关键执行者，相当于哺乳动物中的caspase-9，在杆状病毒感染引发的细胞凋亡通路中起启动作用。通过精准敲除这一基因，研究人员期望能够延缓病毒感染后的细胞死亡进程，从而延长生产窗口，提高重组蛋白产量。
在技术方法层面，本研究主要依靠三大核心技术：一是优化设计的CRISPR-Cas9 RNP复合物组装与递送方案；二是通过下一代测序（Next-generation sequencing）对基因编辑效果进行验证；三是利用杆状病毒表达系统评估工程细胞株在生产三种不同产品模式（rAAV、PfRipr5和iVLPS）时的性能差异。
高效的基因编辑流程建立
研究人员首先以fdl基因作为验证靶点，测试了建立的CRISPR-Cas9 RNP递送系统的效率。结果显示，该方案实现了68%的基因敲除效率，远高于先前报道系统的12%。这一显著提升证明了RNP递送策略在昆虫细胞中的优越性，为后续针对Sf-Dronc的基因编辑奠定了技术基础。
Sf-Dronc敲除细胞株的表型特征
当将这一高效编辑系统应用于Sf-Dronc基因时，研究人员成功获得了多个基因编辑克隆。通过下一代测序验证，这些突变体在宿主基因组的多个等位基因上均存在缺失，证实了基因敲除的成功。表型分析显示，与野生型Sf9细胞相比，工程化细胞株表现出更高的凋亡抗性，并且在杆状病毒感染后，细胞存活率下降的时间明显延迟。这一发现直接证明了Sf-Dronc在昆虫细胞凋亡通路中的核心地位，以及通过基因编辑调控这一通路可行性。
不同产品模式下的生产性能评估
最令人鼓舞的结果来自生产性能评估。研究人员检测了Sf-Dronc敲除细胞株在三种不同产品模式下的表现：重组腺相关病毒（rAAV）、PfRipr5蛋白和流感病毒样颗粒（iVLPS）。研究发现，Sf-Dronc缺失对rAAV和PfRipr5的生产影响微乎其微，但对iVLPS的生产却产生了显著促进作用，产量相比野生型Sf9细胞提高了两倍以上。这一差异化效应提示，凋亡通路的调控对不同产品生产的影响具有特异性，为后续精准优化生产工艺提供了重要启示。
本研究成功建立了一套高效、可靠的昆虫细胞基因编辑流程，解决了长期以来困扰该领域的技术瓶颈。通过靶向调控细胞凋亡关键基因Sf-Dronc，不仅显著提升了细胞在病毒感染压力下的生存能力，更重要的是证明了对宿主细胞进行基因工程改造可以实质性改善生物制药产品的生产效率。特别是iVLPS产量翻倍以上的提升，展示了这一策略在病毒样颗粒疫苗生产中的巨大应用潜力。
该研究的创新性在于将先进的CRISPR-Cas9 RNP技术成功适配于昆虫细胞平台，并通过精准的靶点选择，实现了对细胞工厂性能的定向优化。这一工作不仅为昆虫细胞基因工程提供了强大工具，也为整个生物制药行业开发更高效、更经济的生产平台开辟了新途径。随着对昆虫细胞基因组认识的不断深入和基因编辑技术的持续优化，昆虫细胞表达系统有望在未来的生物医药制造领域发挥更为重要的作用。
