基于全基因组CRISPR筛选揭示PFOS肝毒性调控新机制：SLC6A9/GlyT1与CPSF2的关键作用及跨物种保守性分析

《Archives of Toxicology》：Identification of functional genetic components modulating toxicity response to PFOS using genome-wide CRISPR screens in HepG2/C3A cells

本研究为揭示PFOS肝毒性的分子机制，利用全基因组CRISPR筛选技术在HepG2/C3A细胞中系统鉴定出340个调控PFOS细胞毒性的关键基因（189个敏感基因与151个耐药基因）。研究首次发现SLC6A9/GlyT1（甘氨酸转运体）和CPSF2（mRNA加工因子）的基因敲除可显著增强细胞对PFOS的耐受性，并通过分子对接证实PFOS与GlyT1的直接相互作用。通路富集分析提示DNA损伤应答、细胞周期等通路参与毒性调控，CTD分析显示候选基因与肝癌等疾病显著相关。该研究为PFOS毒性机制提供了新视角，为跨物种风险评估奠定基础。

　　

随着工业化进程加速，大量化学物质进入人类生活与环境，其中全氟和多氟烷基物质（PFAS）因其持久性和生物累积性引发广泛关注。全氟辛烷磺酸（PFOS）作为最具代表性的PFAS之一，虽已被限制生产，仍在全球水体、土壤及生物样本中频繁检出。流行病学研究表明PFOS暴露与肝功能损伤、免疫紊乱及发育异常等多种健康风险相关，尤其在高浓度暴露地区，居民血清ALT（丙氨酸氨基转移酶）水平显著升高，提示肝细胞受损。然而，由于PFOS毒性作用的分子机制尚未明确，其具体致病途径与关键靶点仍是环境毒理学领域的重大挑战。

为系统解析PFOS诱导肝毒性的遗传学基础，研究团队在《Archives of Toxicology》发表最新成果，通过全基因组CRISPR/Cas9敲除筛选技术，在人工肝细胞模型HepG2/C3A中开展功能性遗传元件探索。研究人员首先测定PFOS对细胞的半抑制浓度（IC₂₅为170 μM），利用靶向18,819个人类基因的MinLibCas9文库构建突变细胞池，经18天PFOS暴露后，通过二代测序分析sgRNA丰度变化，筛选出调控PFOS细胞毒性的关键基因。最终鉴定出340个显著候选基因，其中189个基因敲除后增强细胞对PFOS敏感性，151个基因敲除后诱发耐药性。

关键技术方法包括：1）基于CRISPR/Cas9的全基因组功能缺失筛选；2）MaGeCK与PinAPL-Py双算法验证候选基因；3）单体基因敲除验证（SLC6A9与CPSF2）；4）分子对接模拟（AutoDock Vina）预测PFOS与靶蛋白互作；5）抑制剂功能实验（GlyT1抑制剂ALX5407）；6）CTD疾病关联分析与KEGG/STRING通路富集；7）G2P-SCAN跨物种通路保守性分析。

CRISPR筛选鉴定PFOS毒性调控网络

通过阈值筛选（p<0.01，|Log₂FC|>0.6），研究获得340个显著候选基因。耐药基因中，SLC6A9（编码GlyT1）与CPSF2（mRNA 3’末端加工因子）位列前两位，其单基因敲除实验证实可显著提升细胞在PFOS暴露下的存活率（p<0.001）。分子对接显示PFOS可与GlyT1的Y196、Y370等残基形成氢键，结合能（ΔG=-9.5 kcal/mol）优于其天然底物甘氨酸（ΔG=-3.89 kcal/mol），提示PFOS可能竞争性抑制GlyT1功能。

毒性机制与通路富集分析

敏感基因显著富集于胰腺癌、肝细胞癌等疾病相关通路，KEGG分析提示ATP依赖的染色质重塑、化学致癌-DNA加合物等通路激活。STRING聚类显示CXCR5/CXCL5等趋化因子信号、Hedgehog通路与DNA损伤应答网络参与毒性响应。耐药基因则与系统性红斑狼疮、细胞周期等通路相关，其中CTNNB1（β-连环蛋白）、AXIN1等Wnt通路组分富集，提示PFOS可能通过干扰Wnt/β-catenin信号传导诱发代谢紊乱。

跨物种毒性机制保守性

G2P-SCAN分析表明，GlyT1相关通路在哺乳动物中保守性达100%，而斑马鱼、线虫等模式生物保守性降低（74%-21%）。分子对接模拟进一步揭示PFOS与斑马鱼GlyT1/zGlyT2具高亲和力（ΔG=-6.4 kcal/mol），为水生生物PFOS风险评估提供理论依据。

研究通过多组学整合分析，证实PFOS毒性涉及GlyT1介导的底物转运竞争、CPSF2调控的mRNA加工紊乱以及DNA损伤应答通路异常。这些发现不仅为PFOS的肝毒性机制提供新依据，还通过跨物种保守性分析拓展了生态风险评估维度，为制定精准干预策略奠定基础。