《Cancer Immunology, Immunotherapy》：IRAK4 Regulates NF-κB signaling to suppress CD8?+?T cell activity and promote immune evasion in glioblastoma development
胶质母细胞瘤（Glioblastoma Multiforme, GBM）是一种高度侵袭性的恶性脑肿瘤，其治疗面临巨大挑战，部分原因在于肿瘤微环境中复杂的免疫抑制机制限制了免疫疗法的疗效。CD8+T细胞作为适应性免疫的关键效应细胞，在抗肿瘤免疫中扮演着重要角色，然而其在GBM中的功能常常受到抑制。近年来，白细胞介素-1受体相关激酶4（Interleukin-1 Receptor-Associated Kinase 4, IRAK4）在肿瘤免疫调节中的作用逐渐受到关注。本研究通过整合高通量蛋白质组学、生物信息学分析以及系统的体内外实验，深入探讨了IRAK4在GBM进展中调控CD8+T细胞功能及促进免疫逃逸的具体分子机制。
IRAK4通过NF-κB通路调控胶质瘤中CD8+T细胞活性
研究首先对来自临床蛋白质组学肿瘤分析联盟（Clinical Proteomic Tumor Analysis Consortium, CPTAC）的蛋白质组学数据进行了分析，该数据集包含100例胶质母细胞瘤样本和10例正常对照样本。差异表达分析共鉴定出1205个差异表达蛋白，其中371个上调，834个下调。基因本体（Gene Ontology, GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）富集分析显示，这些差异蛋白显著富集于与CD8+T细胞活性、细胞免疫以及NF-κB信号通路、cAMP信号通路、MAPK信号通路等相关的生物学过程和通路中。基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis, GSEA）进一步揭示，与正常脑组织相比，胶质瘤样本中固有免疫、髓系相关特征以及调节性T细胞（Regulatory T Cells, Tregs）相关的信号通路显著富集，同时效应性CD8+T细胞特征也呈现富集，提示胶质瘤微环境中存在免疫抑制状态以及CD8+T细胞功能受限的“祖细胞样耗竭”表型。
为了从众多差异蛋白中筛选出核心调控因子，研究团队应用了LASSO回归模型和随机森林模型进行特征选择。LASSO模型筛选出16个潜在核心蛋白，而随机森林模型筛选出2个。取两者交集后，发现了一个共同的基因——IRAK4。对CPTAC数据的分析证实，IRAK4在胶质母细胞瘤样本中的表达水平显著高于正常对照。进一步的通路关联分析表明，IRAK4与NF-κB信号通路关系最为密切，且IRAK4的表达与经典的NF-κB通路下游靶基因，如NFKBIA、TNFAIP3和BCL3的表达呈显著正相关。此外，蛋白质印迹实验显示，IRAK4及其磷酸化形式（p-IRAK4）在CD8+T细胞中的表达水平高于胶质瘤细胞系GL261和G422。这些发现提示，IRAK4可能通过调控NF-κB通路在CD8+T细胞功能中发挥重要作用。
IRAK4高表达抑制CD8+T细胞的细胞毒性
为了验证上述推测，研究人员首先通过蛋白质印迹法检测了从小鼠胶质母细胞瘤组织和正常对照组织中分离的CD8+T细胞中IRAK4的表达。结果显示，与对照组相比，GBM组CD8+T细胞中IRAK4蛋白表达显著升高。
随后，研究通过体外细胞实验深入探讨了IRAK4对CD8+T细胞功能的影响。利用基因编辑技术构建了IRAK4敲入（Knock-in, KI）和敲除（Knock-out, KO）的CD8+T细胞模型。乳酸脱氢酶（Lactate Dehydrogenase, LDH）释放实验结果表明，与对照敲入组（sg-Con (KI)）相比，IRAK4敲入组（sg-IRAK4 (KI)）CD8+T细胞对靶细胞的杀伤活性（以LDH释放量衡量）显著降低；相反，与对照敲除组（sg-Con (KO)）相比，IRAK4敲除组（sg-IRAK4 (KO)）CD8+T细胞的杀伤活性显著增强。
酶联免疫吸附测定（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA）用于量化CD8+T细胞产生的关键细胞因子。结果显示，IRAK4敲入显著降低了干扰素-γ（Interferon-gamma, IFN-γ）和肿瘤坏死因子-α（Tumor Necrosis Factor-alpha, TNF-α）的分泌水平，而IRAK4敲除则显著提高了这两种细胞因子的水平。
流式细胞术分析进一步揭示了IRAK4对CD8+T细胞效应分子和耗竭标志物的影响。与对照敲入组相比，IRAK4敲入组CD8+T细胞内的颗粒酶B（Granzyme B）表达水平显著下降；而与对照敲除组相比，IRAK4敲除组颗粒酶B表达升高。同时，IRAK4敲入还促进了CD8+T细胞表面耗竭相关标志物程序性死亡受体-1（Programmed Cell Death Protein 1, PD-1）和T细胞免疫球蛋白黏蛋白-3（T-cell Immunoglobulin and Mucin-domain containing-3, TIM-3）的表达。这些结果综合表明，IRAK4不仅削弱了CD8+T细胞的直接杀伤能力和细胞因子分泌功能，还驱动其向功能耗竭状态分化。
IRAK4通过影响CD8+T细胞调控胶质母细胞瘤的发生发展
为了探究IRAK4调控的CD8+T细胞如何影响胶质瘤细胞的恶性行为，研究人员将不同处理组的CD8+T细胞与胶质瘤细胞系（GL261和G422）进行共培养。
细胞计数试剂-8（Cell Counting Kit-8, CCK-8）实验用于评估肿瘤细胞的增殖能力。结果发现，与对照敲入组共培养相比，与IRAK4敲入组CD8+T细胞共培养的GL261和G422细胞的增殖能力显著增强。反之，与IRAK4敲除组CD8+T细胞共培养则抑制了胶质瘤细胞的增殖。
Transwell实验被用来检测肿瘤细胞的迁移和侵袭能力。结果显示，与IRAK4敲入组CD8+T细胞共培养后，GL261和G422细胞的迁移和侵袭能力均显著提升；而与IRAK4敲除组CD8+T细胞共培养则抑制了这些恶性表型。
流式细胞术检测细胞凋亡的结果表明，与IRAK4敲入组CD8+T细胞共培养，减少了GL261和G422细胞的凋亡；而与IRAK4敲除组CD8+T细胞共培养则促进了肿瘤细胞的凋亡。
综上所述，IRAK4通过抑制CD8+T细胞的抗肿瘤功能，进而促进了胶质瘤细胞的增殖、迁移和侵袭，并抑制了其凋亡，从而在整体上推动了肿瘤的进展。
IRAK4通过NF-κB通路促进胶质母细胞瘤进展：NF-κB抑制剂的逆转效应
已有文献报道IRAK4可通过激活NF-κB通路参与炎症反应调控。因此，研究进一步探讨了IRAK4是否通过NF-κB通路影响CD8+T细胞功能。
蛋白质印迹分析显示，IRAK4敲入显著提高了CD8+T细胞中NF-κB关键亚基p65的磷酸化水平（p-p65/p65比值）。当加入NF-κB通路抑制剂雷公藤甲素（Triptolide）后，这种磷酸化水平的升高被有效逆转。
功能实验证实了NF-κB通路在此过程中的关键作用。与仅进行IRAK4敲入并加入溶剂二甲基亚砜（DMSO）的对照组（sg-IRAK4 (KI) + DMSO）相比，同时加入Triptolide的处理组（sg-IRAK4 (KI) + Triptolide）中，CD8+T细胞的LDH释放量增加，IFN-γ和TNF-α的分泌水平回升，颗粒酶B的表达上调，而PD-1和TIM-3的表达下降。为了验证结果的特异性，研究还使用了另一种NF-κB特异性抑制剂BMS-345541，得到了与Triptolide一致的结果，表明NF-κB通路的抑制确实能够逆转IRAK4对CD8+T细胞功能的抑制作用。
为了从基因组层面理解IRAK4的影响，研究人员对IRAK4敲入和对照的CD8+T细胞进行了RNA测序（RNA-seq）和GSEA分析。结果显示，IRAK4敲入显著富集了HALLMARK_TNFA_SIGNALING_VIA_NFKB通路，同时上皮-间质转化（Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT）等相关通路被显著负向富集。在基因表达水平上，IRAK4敲入导致经典NF-κB负反馈调节因子（如Nfkbia, Tnfaip3）表达上调，而效应分子（如Ifng, Gzmb）表达下调，耗竭相关标志物（如Pdcd1, Havcr2）表达上调，这从转录组层面支持了IRAK4-NF-κB轴驱动CD8+T细胞功能耗竭的结论。
接下来，研究深入探讨了IRAK4激活NF-κB通路的具体分子机制，重点关注了NF-κB通路的关键抑制蛋白IκBα。蛋白质印迹结果显示，IRAK4敲除显著降低了IκBα的磷酸化水平。蛋白质稳定性实验表明，IRAK4敲除增强了IκBα的蛋白质稳定性。免疫共沉淀实验进一步发现，IRAK4敲除抑制了IκBα的泛素化水平。这些结果提示，IRAK4可能通过促进IκBα的磷酸化和后续的泛素化降解，从而解除对NF-κB的抑制，激活该信号通路。
在共培养体系中，NF-κB通路抑制剂的加入同样逆转了IRAK4敲入CD8+T细胞对胶质瘤细胞恶性行为的促进作用。与sg-IRAK4 (KI) + DMSO组相比，sg-IRAK4 (KI) + Triptolide组中，与CD8+T细胞共培养的GL261和G422细胞的增殖、迁移和侵袭能力受到抑制，而凋亡增加。使用BMS-345541也得到了类似的结果。这些数据充分证明，IRAK4主要是通过调控NF-κB信号通路来影响CD8+T细胞功能，进而影响胶质瘤的进展。
IRAK4通过阻碍CD8+T细胞浸润和调节免疫逃逸机制促进胶质母细胞瘤肿瘤发生：体内验证及NF-κB通路抑制
为了在活体动物模型中验证上述体外研究发现，研究团队构建了原位胶质瘤小鼠模型，并 adoptive transfer 了经过基因修饰的CD8+T细胞（分为sg-Con (KI)组和sg-IRAK4 (KI)组）。
活体成像技术监测肿瘤生长显示，与sg-Con (KI)组相比，sg-IRAK4 (KI)组小鼠的肿瘤体积更大，生长速度更快。而在sg-IRAK4 (KI)组小鼠中给予Triptolide治疗，则有效抑制了由IRAK4敲入所促进的肿瘤生长。
对小鼠肿瘤组织进行ELISA检测发现，与sg-Con (KI)组相比，sg-IRAK4 (KI)组肿瘤组织中IFN-γ、TNF-α和白介素-2（Interleukin-2, IL-2）的水平降低，而PD-1的水平升高。Triptolide治疗逆转了这些因子的表达变化。从肿瘤组织中分离出的CD8+T细胞也显示出类似的变化趋势。此外，比较脾脏和肿瘤浸润CD8+T细胞发现，肿瘤内的CD8+T细胞表现出更高的PD-1、TIM-3表达和p-p65水平，提示肿瘤微环境中NF-κB通路的过度激活与CD8+T细胞耗竭密切相关。
免疫组织化学染色结果显示，与sg-Con (KI)组相比，sg-IRAK4 (KI)组胶质瘤组织中的CD8+T细胞浸润明显减少。Triptolide治疗则显著增加了肿瘤组织中的CD8+T细胞浸润。
流式细胞术分析了肿瘤微环境中的免疫细胞群体。结果显示，与sg-Con (KI)组相比，sg-IRAK4 (KI)组肿瘤中CD8+T细胞比例减少，而调节性T细胞（Tregs，标志为CD4+CD25+）和髓源性抑制细胞（Myeloid-Derived Suppressor Cells, MDSCs，标志为CD11b+CD33+）的比例增加。Triptolide治疗则逆转了这种免疫抑制微环境，增加了CD8+T细胞比例，降低了Tregs和MDSCs的比例。
这些体内实验数据有力地证实，IRAK4通过激活NF-κB通路，抑制CD8+T细胞的抗肿瘤功能及其向肿瘤部位的浸润，同时塑造免疫抑制性的肿瘤微环境，从而促进胶质母细胞瘤的免疫逃逸和生长。
讨论
本研究系统性地揭示了IRAK4在胶质母细胞瘤免疫微环境中的关键作用。研究发现，IRAK4在GBM中表达上调，并通过促进IκBα磷酸化和泛素化降解，激活NF-κB信号通路。NF-κB通路的持续激活进而抑制了CD8+T细胞的细胞毒性功能（表现为LDH释放、颗粒酶B表达、IFN-γ和TNF-α分泌减少），并诱导其表达PD-1、TIM-3等耗竭标志物，呈现功能耗竭状态。功能受损的CD8+T细胞无法有效抑制胶质瘤细胞的增殖、迁移和侵袭，并抵抗凋亡。体内实验进一步表明，IRAK4还限制了CD8+T细胞在肿瘤组织中的浸润，并促进了Tregs和MDSCs等免疫抑制细胞的聚集，共同营造了有利于肿瘤生长的免疫抑制微环境。重要的是，使用NF-κB通路抑制剂（Triptolide或BMS-345541）能够显著逆转IRAK4介导的上述效应。
本研究的创新之处在于首次将IRAK4与GBM中CD8+T细胞的功能耗竭及免疫逃逸直接联系起来，并阐明了其通过NF-κB通路发挥作用的具体分子机制。研究中整合了蛋白质组学、生物信息学、体外细胞模型和体内动物模型等多种技术手段，为结论提供了多层次证据。
当然，本研究也存在一些局限性。例如，所使用的NF-κB抑制剂Triptolide具有一定程度的多效性，未来研究可采用基因敲除等更特异的手段进一步验证NF-κB的核心作用。样本量相对有限，后续需要更大规模的临床样本进行验证。研究主要聚焦于CD8+T细胞，其他免疫细胞在IRAK4调控的肿瘤微环境中的作用有待进一步探索。
尽管存在这些局限，本研究无疑为理解胶质母细胞瘤的免疫逃逸机制提供了新的重要视角。IRAK4作为连接先天免疫信号和适应性T细胞功能的关键节点分子，其抑制剂（已有部分进入临床研究用于其他疾病）可能成为增强GBM免疫治疗疗效的潜在策略。通过靶向IRAK4-NF-κB轴，有望恢复CD8+T细胞的抗肿瘤能力，改善免疫细胞浸润，从而为攻克这种恶性程度极高的肿瘤提供新的希望。
