《Cancer Immunology, Immunotherapy》：Dual targeting of CD155 augments the antitumor efficacy of ROR1-CAR-T cells in ovarian cancer
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本研究针对卵巢癌靶向治疗靶点匮乏及免疫抑制微环境限制CAR-T疗效的难题，通过构建ROR1/CD155双特异性CAR-T细胞，证实CD155作为促癌因子可驱动卵巢癌增殖、迁移并诱导T细胞耗竭，而双靶向CAR-T能显著增强细胞毒性、缓解持续性信号激活导致的T细胞衰竭，为卵巢癌免疫治疗提供了新策略。
卵巢癌作为妇科恶性肿瘤中致死率最高的癌种，多数患者确诊时已处于晚期，尽管PARP抑制剂等维持疗法在一定程度上延长了无进展生存期，但长期预后仍不理想。尤其对于复发或难治性患者，传统治疗手段效果有限，亟需开发新型治疗策略。近年来，嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）疗法在血液肿瘤中取得突破性进展，但其在实体瘤中的应用仍面临诸多挑战，包括靶抗原选择受限、免疫抑制性肿瘤微环境（TME）以及T细胞浸润不足等。因此，探索兼具肿瘤特异性表达与免疫调控功能的理想靶点，成为提升实体瘤CAR-T疗效的关键。
本研究聚焦于受体酪氨酸激酶样孤儿受体1（ROR1）和脊髓灰质炎病毒受体（CD155）这两个潜在靶点。ROR1在胚胎发育阶段高表达，而在成人正常组织中几乎不表达，但在多种肿瘤（包括卵巢癌）中显著上调，使其成为理想的CAR-T靶点。然而，单靶向ROR1的CAR-T细胞在体外实验中虽展现强大肿瘤杀伤能力，却存在持续性信号激活（Tonic Signaling）导致的快速耗竭问题。另一方面，CD155作为免疫调节分子，在卵巢癌中广泛表达，但其在肿瘤进展与免疫逃逸中的具体作用尚不明确。研究人员由此提出科学假设：能否通过双靶向CD155与ROR1，既增强CAR-T的抗肿瘤活性，又改善其持久性？
为验证这一设想，团队首先通过流式细胞术确认ROR1与CD155在卵巢癌细胞系中的表达谱，并利用单细胞RNA测序数据分析二者在正常卵巢组织中的表达情况，确保靶向安全性。随后，通过体外功能实验阐明CD155的促癌机制：CD155过表达显著促进卵巢癌细胞增殖、迁移和血管生成相关分子（如VEGF、CD31）的上调，同时抑制共培养T细胞的活化标志物（如CD69）表达，并诱导耗竭标志物（PD-1、TIM-3、LAG-3、TIGIT）升高。这些结果证实CD155通过驱动肿瘤恶性行为与抑制T细胞功能双重作用，塑造免疫抑制性微环境。
在机制明确的基础上，研究团队设计并构建了单靶向ROR1-CAR、单靶向CD155-CAR以及双特异性ROR1/CD155-CAR的慢病毒载体，转导至健康供者来源的T细胞中制备CAR-T细胞。通过细胞毒性实验、细胞因子释放检测及重复抗原刺激模型，系统评估不同CAR-T细胞的抗肿瘤功能与耐久性。结果显示，双特异性CAR-T在低效应靶比（如1:3、1:9）下仍保持显著优于单靶向CAR-T的杀伤效率，且通过阻断CD155-TIGIT等抑制性信号通路，有效缓解了ROR1-CAR-T固有的持续性信号激活问题，降低耗竭标志物表达，维持效应记忆T细胞（CD45RO+CCR7?）亚群比例。此外，双靶向策略还显示出对乳腺癌、结直肠癌等其他CD155阳性肿瘤细胞的跨瘤种杀伤潜力。
本研究主要采用以下关键技术方法：
- 1.
利用流式细胞术与单细胞RNA测序分析靶点表达谱；
- 2.
通过体外功能实验（CCK-8、EdU、Transwell、伤口愈合实验）评估CD155对肿瘤恶性行为的影响；
- 3.
构建单靶向与双特异性CAR-T细胞，并通过细胞毒性实验、细胞因子检测及重复抗原刺激模型验证其疗效与耐久性；
- 4.
采用生物信息学方法（CIBERSORT、GSEA）分析CD155表达与免疫细胞浸润、信号通路富集的相关性。
ROR1-CAR-T细胞高效靶向卵巢癌细胞但存在过度持续性信号
通过流式细胞术检测发现ROR1在多个卵巢癌细胞系中均有表达，其中SKOV3-ROR1细胞系表达最高。构建ROR1特异性CAR-T细胞后，其在体外展现出强效的肿瘤杀伤能力，尤其在效应靶比为1:1时效果显著。然而，无靶细胞刺激条件下，ROR1-CAR-T细胞分泌高水平IFN-γ，提示存在持续性信号激活，可能导致体内快速耗竭。
CD155正向调控卵巢癌增殖与迁移
生存分析显示CD155高表达与卵巢癌患者不良预后相关。体外实验表明，CD155过表达显著增强卵巢癌细胞活力、增殖能力及迁移侵袭性，同时上调血管生成相关分子VEGF与CD31的表达，提示其通过促进肿瘤血管化间接阻碍T细胞浸润。
CD155抑制T细胞功能
共培养实验发现，CD155过表达的卵巢癌细胞可抑制Jurkat T细胞的活化标志物（如CD69）表达，减少IFN-γ、TNFα、穿孔素等效应分子分泌，并上调PD-1、TIM-3等耗竭标志物，证实CD155直接参与T细胞功能抑制。
双靶向CD155增强ROR1-CAR-T细胞的抗肿瘤能力
双特异性CAR-T细胞在低效应靶比下展现出优于单靶向CAR-T的细胞毒性，且其活化标志物CD69、CD25表达更高，IFN-γ、IL-2分泌量增加。此外，双靶向设计显著缓解了单靶向ROR1-CAR-T的持续性信号激活，降低耗竭标志物表达，提升长期抗肿瘤稳定性。
共靶向CD155缓解持续性信号并减少耗竭
在无抗原刺激条件下，双特异性CAR-T细胞IFN-γ分泌量显著低于ROR1-CAR-T组。重复抗原刺激实验进一步证实，双靶向细胞能维持更高的CAR阳性率及效应记忆T细胞比例，延缓耗竭进程。
本研究的结论部分强调，CD155作为卵巢癌免疫治疗的新靶点，不仅通过驱动肿瘤增殖、迁移与血管生成直接促进恶性进展，还通过抑制T细胞功能塑造免疫抑制微环境。双靶向CD155/ROR1的CAR-T策略成功整合了靶向特异性与免疫调节功能，在提升抗肿瘤活性的同时有效缓解T细胞耗竭，为克服实体瘤CAR-T治疗障碍提供了新思路。尽管未来仍需通过体内实验与临床样本验证其安全性与普适性，但此项工作无疑为卵巢癌及其他CD155阳性实体瘤的免疫治疗开辟了值得探索的方向。
