《Cell and Tissue Research》：Rab24 protein levels show dynamic changes in mouse tissues and human cancers
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本综述系统揭示了Rab24蛋白在小鼠组织发育过程中的动态表达模式及其在人类癌症中的差异表达。通过Western blot和免疫组化技术，研究团队绘制了从出生后到成年期多个组织器官中Rab24的蛋白表达图谱，并深入分析了其在神经元、上皮细胞等特定细胞类型中的定位。尤为重要的是，文章首次在多种人类癌症组织微阵列中发现了Rab24的癌症类型特异性表达模式，特别是在髓母细胞瘤、神经母细胞瘤和胰腺神经内分泌肿瘤中的显著变化，为理解Rab24在肿瘤发生发展中的双重角色提供了新的分子视角。
Rab24蛋白水平在小鼠组织和人类癌症中呈现动态变化
Rab24是Rab小GTP酶家族中一个不寻常的成员，参与自噬、内吞作用和细胞分裂过程。为了阐明Rab24可能存在的器官和年龄特异性功能，研究团队通过Western blot和免疫组化技术，从小鼠出生后第一天到9月龄期间，系统研究了其组织特异性表达水平。
年龄特异性Rab24水平在小鼠组织中的表达特征
在成年小鼠中，大脑中的Rab24蛋白水平最高，其次是肾脏，而在胰腺、脾脏、肝脏、肺、心脏和骨骼肌中检测到的水平较低。在出生后早期发育过程中观察到Rab24水平的动态变化，大脑中的Rab24水平在出生后第14天急剧增加，此后一直保持高水平直至成年期。在心脏、骨骼肌、胰腺和肝脏中，在出生后前两周观察到较高的Rab24水平，此后水平下降并保持较低直至成年。这些年龄依赖性变化表明Rab24蛋白水平存在年龄和器官特异性调控，以及Rab24在发育和成熟中可能具有器官特异性作用。
大脑免疫组化显示，在1月龄及更大月龄的小鼠中，Rab24主要存在于神经元细胞中。此外，几种组织中的上皮细胞也显示出高Rab24水平。这些结果提示Rab24在神经元和上皮维持中可能发挥作用。
组织特异性Rab24水平随年龄的变化规律
为了可靠比较每个器官在出生后发育和衰老过程中的Rab24水平，研究人员进行了额外的Western blot实验，将每个组织的所有样本加载在同一凝胶上。这种比较中，Rab24水平均一化为每个组织中1日龄样本的水平。
大脑中的Rab24水平从14日龄开始显著增加，与1日龄和7日龄样本相比增加了4-5倍。升高的水平在1月龄、3月龄、6月龄和9月龄大脑中持续保持。与大脑相反，心脏和骨骼肌中的Rab24水平在出生后早期发育期间达到峰值，随后在成年组织中显著降低。胰腺和肝脏中的Rab24水平也显示出显著的年龄相关模式。
相比之下，肾脏中的Rab24水平在所有年龄组中保持稳定。脾脏和肺中的Rab24水平随年龄变化也较小。这些发现共同凸显了不同组织间Rab24蛋白的独特年龄依赖性模式，表明存在Rab24蛋白水平的组织特异性调控机制。
大脑中Rab24的神经元特异性定位
鉴于大脑在所有测试器官中表现出最高的Rab24水平，研究人员接下来使用免疫组化技术研究了Rab24在不同脑区和细胞类型中的定位。为了探索染色随年龄的潜在变化，他们分析了7日龄、1月龄、3月龄和6月龄小鼠的脑组织。
基于Rab24阳性细胞的形态，在1月龄及更大月龄的大脑的各种脑区中，Rab24蛋白主要定位于神经元。各生物学重复间的染色模式一致。区域特异性分析显示整个丘脑中存在Rab24阳性神经元。
与小鼠大脑类似，成人脑组织中的神经元也显示出最强的RAB24染色。这些发现与Western blot分析中14日龄后脑组织中持续高Rab24蛋白水平的结果一致。
不同类型上皮细胞中的Rab24染色
免疫组化显示多个器官的上皮细胞中存在Rab24染色，染色模式存在显著的年龄依赖性差异。虽然7日龄小鼠的上皮染色模式有些变化，但较大月龄小鼠的组织显示出更一致的染色强度。
脑室中的室管膜细胞在所有年龄组中均显示出Rab24染色。在肾脏中，年轻和年长动物中Rab24染色遵循相似模式，近曲小管上皮细胞中的染色强度高于远曲小管和肾小球。在肺中，所有年龄组的细支气管上皮中Rab24染色均显著，但年轻和年老组织的肺泡衬里染色存在差异。
与人类成人组织的比较分析显示，成人肾脏、肺和胰腺中的RAB24染色模式与成年小鼠组织中观察到的相似。这些发现表明Rab24在维持上皮结构完整性方面可能具有进化保守作用。
心脏、骨骼肌、肝脏和脾脏中的Rab24染色
在心脏中，7日龄动物的心肌细胞中Rab24染色中等，但在1月龄小鼠中显著降低。在年长小鼠中，心肌细胞和心脏内皮细胞均显示低Rab24染色。在骨骼肌中观察到类似但不太显著的年龄依赖性Rab24染色减少。相比之下，肝脏中的Rab24染色在免疫组化分析包括的所有年龄组中均保持较低水平。在脾脏中，7日龄和年长动物中Rab24染色均为中等，白髓和红髓染色均匀。
人类成人组织的分析显示，骨骼肌和肝脏中的RAB24染色模式与成年小鼠组织中观察到的相似，进一步支持了Rab24表达模式的物种间保守性。
Rab24染色与自噬和内吞/溶酶体区室标志物的比较
为了评估Rab24染色模式是否与这些过程的标志物相关，研究人员使用了显示Rab24染色存在年龄或细胞类型依赖性变化组织的切片，并用自噬标志物以及内吞和溶酶体区室标志物进行免疫标记。
在小脑中，浦肯野细胞在7天和1个月时均显示LC3染色，与Rab24染色模式一致。然而，LC3染色在颗粒层细胞中也观察到，尤其是在1个月时，这与Rab24不同。Beclin1在7天和1个月时在浦肯野细胞和颗粒层中均显示弱至中度染色，而SQSTM1/p62在7天时呈阴性，在1个月时在浦肯野细胞中呈阳性。
在肾脏中，LC3染色在7日龄和1月龄组织的曲小管和肾小球中均存在，而Rab24在肾小管中染色但不在肾小球中。在肺中，LC3染色在7天和1个月时均在细支气管上皮中观察到，而肺泡衬里在7天时呈阳性但在1个月时呈阴性。在胰腺中，LC3染色在7天和1个月时在胰岛细胞中均强于腺泡细胞，腺泡染色在7天时高于1个月时。
这些比较结果表明，Rab24染色模式与自噬和内吞/溶酶体途径的不同组成部分存在不同程度的相关性，表明Rab24可能以细胞类型特异性方式参与这些细胞过程。
Rab24敲除导致神经元功能、细胞信号传导和免疫相关基因下调
为了深入了解Rab24的细胞功能，研究人员对Rab24敲除和野生型小鼠Neuro-2a细胞进行了RNA测序。选择该模型是因为成年脑组织中Rab24蛋白水平最高，且神经元中染色最强。两个独立的Rab24敲除克隆与野生型细胞一起进行分析。对Rab24敲除克隆中差异表达基因进行了基因本体分析。
Rab24敲除克隆中下调基因的常见GO术语包括记忆、膜电位调控、大脑发育、神经系统发育、细胞分化、信号转导、细胞外基质组织、炎症反应、血管生成、转录调控、细胞增殖和免疫反应。这些发现表明Rab24在神经元和上皮细胞中观察到的发育和维持功能中可能发挥作用。
人类癌症中的RAB24水平
RAB24在自噬、内吞作用、有丝分裂以及细胞增殖和迁移中的已知参与，表明改变的RAB24蛋白水平可能有助于恶性转化和肿瘤进展。鉴于在出生后发育和衰老过程中观察到小鼠Rab24的动态和组织特异性水平，研究人员试图研究RAB24水平在癌症中是否发生改变。
为了解决这个问题，他们首先使用多癌组织微阵列通过免疫组化分析了来自220名患者的75种肿瘤类型中的RAB24水平。使用H-score对RAB24染色强度进行量化。H-score分析显示，与肿瘤一起切除的正常组织表现出更平衡的分布。
为了提供概览，研究人员总结了对所有75种癌症类型的发现。数据显示癌症中RAB24水平存在明显模式。大多数癌症与正常组织相比，恶性组织中的RAB24水平升高，包括几种乳腺癌和皮肤癌亚型。相反，24%的癌症，特别是消化系统和泌尿道的癌症，与正常组织相比，恶性组织中的RAB24水平降低。
脑癌和神经母细胞瘤中的RAB24蛋白
由于发现小鼠大脑中Rab24蛋白水平最高，研究人员接下来研究了人类神经肿瘤中的RAB24是否也发生改变。分析了两个组织微阵列，一个包括正常脑组织和几种脑瘤类型的中枢神经系统肿瘤组织微阵列，另一个包括周围神经和神经母细胞瘤亚型的神经母细胞瘤组织微阵列。
在中枢神经系统组织微阵列中，在所有肿瘤类型中均观察到RAB24染色，强度可变。与癌旁正常脑组织相比，在髓母细胞瘤中检测到RAB24 H-score显著增加。神经母细胞瘤是儿童中最常发生的颅外肿瘤，起源于神经嵴细胞。在神经母细胞瘤组织微阵列中，与正常周围神经相比，肿瘤组织中的RAB24染色持续更强。
胰腺神经内分泌肿瘤中的RAB24水平
有报道称RAB24在源自胰腺外分泌腺泡细胞的胰腺腺癌患者样本和细胞系中表达降低。然而，关于源自内分泌胰腺胰岛细胞的胰腺神经内分泌肿瘤中RAB24表达的数据尚无。因此，研究人员分析了来自120名患者的胰腺神经内分泌肿瘤组织微阵列中的RAB24蛋白水平。
分析显示，与正常组织相比，正常组织胰岛细胞中的RAB24染色显著高于肿瘤和肿瘤边缘样本。肿瘤和肿瘤边缘样本之间未观察到RAB24水平差异。为了确定RAB24蛋白水平是否随肿瘤分级变化，研究人员进行了Ki-67免疫组化染色。基于Ki-67指数，大多数胰腺神经内分泌肿瘤样本被分类为低级别，而6%被分类为中级别，1.7%为高级别。RAB24 H-score的定量分析显示，较高级别肿瘤中RAB24染色显著降低，胰腺神经内分泌肿瘤G1样本显示的RAB24水平高于G2和G3肿瘤。
RAB24蛋白和mRNA水平与某些癌症患者生存率相关
为了探索RAB24在癌症中可能的临床相关性，研究人员使用UALCAN门户将免疫组化结果与癌症基因组图谱中的RAB24 mRNA表达和患者生存数据进行了比较。
分析了六种代表不同RAB24表达模式的癌症类型。在胰腺腺癌中，肿瘤中的RAB24 mRNA水平显著低于正常胰腺，与多癌组织微阵列免疫组化结果一致。此外，高RAB24表达的患者总生存期显著改善。相反，与正常肝脏相比，肝细胞癌中的RAB24 mRNA显著上调，与免疫组化显示恶性肝细胞中较高H-score的结果一致。肿瘤中高RAB24 mRNA表达的患者总生存期降低。在肺鳞状细胞癌中，正常和肿瘤组织间的RAB24 mRNA表达或蛋白水平均无差异，高和低/中RAB24表达组间的总生存期无显著差异。
这些例子表明，RAB24 mRNA和蛋白水平可能显示与患者预后有利或不利的相关性，或者根本没有相关性，这取决于癌症类型。
结论与启示
本研究通过Western blot和免疫组化，系统表征了小鼠组织中年龄、组织和细胞类型特异性的Rab24蛋白水平。早期发育过程中Rab24蛋白水平的动态变化提示其在器官成熟中可能发挥作用，特别是在大脑、心脏、骨骼肌、胰腺和肝脏中，而其在成年期的稳定水平可能反映了其在分化细胞中的可能维持功能。
在癌症背景下，RAB24蛋白水平表现出明显的癌症特异性改变。RAB24在乳腺癌和皮肤癌中较相应正常组织增加，而在消化系统和尿道癌症中则发现相反情况。在脑癌和神经母细胞瘤组织微阵列中，源自神经元细胞的髓母细胞瘤和神经母细胞瘤中RAB24水平升高。在胰腺神经内分泌肿瘤中，RAB24水平低于正常胰岛细胞，并且在较高级别肿瘤中发现RAB24水平降低，提示RAB24丢失可能与更具侵袭性的肿瘤行为相关。
尽管Rab24蛋白水平不能直接指示功能意义，但本研究结果凸显了Rab24作为细胞增殖、迁移、分化和稳态的潜在调节因子，这些过程与发育和肿瘤发生均相关。未来研究应侧重于确定Rab24的分子机制和相互作用伙伴、其组织特异性功能，以及其在人类疾病中作为诊断和治疗靶点的潜力。
