《Cell and Tissue Research》：Pannexin-1 is present in a subpopulation of bovine milk–derived small extracellular vesicles
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本研究针对Pannexin-1（Panx1）在细胞外囊泡（EVs）中存在形式尚未明确的问题，首次通过Western blotting、单分子定位显微镜和流式细胞术等多种技术证实Panx1特异性存在于牛乳源性小细胞外囊泡（mEVs）亚群中。该发现拓展了膜通道蛋白在EVs中的组成图谱，为探究Panx1在囊泡生物学及介导信号传递中的功能作用奠定基础。
在生命科学领域，细胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs）作为细胞间通讯的关键信使，近年来受到广泛关注。这些小膜泡结构（直径小于200纳米）由大多数细胞分泌，携带蛋白质、脂质、核酸等重要生物活性分子，在多种生理和病理过程中扮演着角色。其中，源自牛乳的细胞外囊泡（milk-derived small Extracellular Vesicles, mEVs）因其稳定性好、生物利用度高、可口服且免疫原性低等优势，不仅在新生儿发育和免疫调节中具有潜在作用，更作为极具前景的药物递送载体被深入研究。
尽管对细胞外囊泡的认识不断深入，但其表面携带的膜通道蛋白的种类和功能仍有许多未知。此前研究发现，间隙连接蛋白Connexin-43（Cx43）可存在于细胞外囊泡中，并可能参与囊泡与靶细胞间的通讯。这引发了一个新的科学问题：在结构上与Cx43相似的另一种重要膜通道蛋白——Pannexin-1（Panx1），是否也同样存在于细胞外囊泡中？Panx1以其形成大孔径通道并介导ATP释放而闻名，在嘌呤能信号传导、炎症和细胞死亡等通路中起关键调节作用。虽然有研究提示Panx1的活性可能影响外泌体（exosomes）的分泌，但Panx1本身是否作为货物蛋白被包装进细胞外囊泡，尤其是在牛乳这类复杂的生物体液来源的囊泡中，此前缺乏确凿的实验证据。解决这一问题，对于完整理解细胞外囊泡的分子构成和功能多样性至关重要。
为了回答这一问题，研究人员在《Cell and Tissue Research》上发表了一项研究，首次证实Panx1确实存在于牛乳来源的小细胞外囊泡的一个特定亚群中。
关键技术方法概述
研究人员采用了一种已建立的、可规模化生产的方法从生牛乳中分离高质量小细胞外囊泡。该方法的关键步骤包括使用EDTA（乙二胺四乙酸）螯合钙离子以解离酪蛋白胶束，从而释放被包裹的囊泡，随后结合切向流过滤（Tangential Flow Filtration, TFF）和尺寸排阻色谱（Size-Exclusion Chromatography, SEC）进行纯化和浓缩。获得的mEVs通过多种技术进行表征，包括纳米颗粒跟踪分析（Nanoparticle Tracking Analysis, NTA）测定囊泡粒径和浓度，Western blotting检测囊泡标志蛋白（如CD9, CD81, TSG-101, Syntenin）和阴性标志物（Calnexin），以及透射电子显微镜（Transmission Electron Microscopy, TEM）观察囊泡形态。检测Panx1的存在则运用了三种互补技术：使用针对Panx1 C末端和胞外环区域的不同抗体进行Western blotting分析；利用单分子定位显微镜（Single-Molecule Localization Microscopy, SMLM）在单囊泡水平观察Panx1与囊泡标志物CD9的共定位；以及基于流式细胞术的囊泡检测方法对Panx1阳性的囊泡亚群进行定量。
研究结果
牛乳源性小细胞外囊泡的分离与表征
研究人员成功分离出高纯度的牛乳源性小细胞外囊泡。表征结果显示，分离的囊泡形态完整，平均直径约为123.7纳米，颗粒浓度高，且富含CD9、CD81、TSG-101和Syntenin等经典的小细胞外囊泡标志蛋白，而内质网标志物Calnexin未被检测到，证实了所获囊泡群体的质量。5 × 10^12 mEVs per ml, with an average nanoparticle size of 123.7 nm, consistent with small EVs. c Negative stain transmission electron microscopy (TEM) indicating dense accumulations of mEVs generated by the isolation protocol. A five times zoom-in image of a single mEV in the inset shows that isolated mEVs maintained their characteristic spherical morphology and intact lipid bilayers. d Single-molecule localization microscopy (SMLM) images of an isolated mEV tagged for CD81 (red), CD9 (pink), and CD63 (teal)">
Pannexin-1存在于乳源细胞外囊泡亚群中
通过Western blotting，在mEVs裂解物中清晰检测到了与阳性对照HeLa细胞裂解物迁移位置一致的Panx1免疫反应条带，分别被针对其C末端和胞外环的两个独立抗体所识别。单分子定位显微镜成像进一步显示，部分（而非全部）CD9阳性的mEVs上也存在Panx1的信号，这表明Panx1并非均匀分布于所有囊泡，而是特异性地存在于一个囊泡亚群中。流式细胞术的定量分析结果与此一致，表明大约有48.6%（单标）至44.7%（双标）的检测到的囊泡为Panx1阳性。这些多角度的证据共同强有力地证实了Panx1是牛乳源性小细胞外囊泡的一个组成部分，并且其分布具有亚群特异性。
研究结论与意义
本研究首次提供了经过验证的证据，表明Pannexin-1（Panx1）作为蛋白质货物存在于牛乳来源的小细胞外囊泡中。该发现不仅扩展了目前对mEVs蛋白质组成的认知，将Panx1增添至与细胞外囊泡相关的膜通道蛋白名录中，更重要的是，它揭示了Panx1生物学的一个新维度：Panx1不仅是细胞膜上重要的通道蛋白，调控囊泡的分泌过程，其本身也可以被纳入到细胞外囊泡中。这种存在于特定囊泡亚群的现象，提示mEVs群体内部存在功能特化的异质性。
这一发现为未来研究开辟了多个方向。首先，需要探究Panx1在其它来源的细胞外囊泡中是否存在，以判断其是否是囊泡的普遍组分还是特定于某些组织或体液。其次，功能研究至关重要，需要验证位于囊泡膜上的Panx1是否仍保持通道活性（例如介导ATP流动），并比较Panx1阳性与阴性的mEVs亚群在被细胞摄取效率以及生物学效应上是否存在差异。鉴于牛乳源性小细胞外囊泡能够跨越物种屏障并产生系统性效应，探索Panx1阳性的mEVs是否在免疫调节、代谢适应或更广泛的细胞间通讯中发挥独特作用，具有重要的科学意义和潜在的应用前景。总之，这项工作为深入理解Panx1在细胞外囊泡介导的信号传递中的功能角色奠定了坚实的基础。
