《Journal of Advanced Research》：An injectable microsphere-reinforced system for sustained delivery of Adipo-MBV in adipose tissue engineering
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本研究针对软组织工程中脱细胞脂肪基质（AAM）应用时存在的成脂和血管化不足等问题，开发了一种负载脂肪源性基质结合纳米囊泡（Adipo-MBV）的聚多巴胺（PDA）涂层透明质酸甲基丙烯酸酯（HAMA）微球（PDA@HMs）与AAM-HAMA（A/H）杂化水凝胶的复合递送系统。研究证实，源自机械浓缩细胞外基质（ECM）的M-AT-MBV比源自化学脱细胞基质的C-AT-MBV具有更强的诱导成脂和血管生成能力。该复合系统在小鼠模型中实现了M-AT-MBV的持续释放，显著促进了血管化脂肪组织的再生，其优异性能与M-AT-MBV中富含的miR-143及其对MAPK信号通路的下调有关。该研究为软组织再生提供了一种新颖且有效的策略。
全球范围内，创伤性损伤和软组织缺损及其相关的后遗症，如瘢痕、畸形和功能障碍，仍然是严重的医疗负担。传统的治疗方法在满足组织修复和功能恢复的需求方面面临巨大挑战。在过去几十年中，组织工程已成为再生医学领域的一种革命性范式，其利用先进的生物材料来重建受损组织和恢复功能。其中，脱细胞脂肪基质（AAM）因其在移植部位具有自发的成脂特性且在同种异体移植中免疫原性低，已成为一种有前景的再生生物材料。AAM的水凝胶形式通常被用作软组织填充的合适生物材料。然而，AAM在应用中存在成脂和血管化不足的局限，这限制了其效果，表现为仅在AAM移植物周边区域的新血管附近检测到有限的新生脂肪细胞。
为了克服这些挑战，研究人员将目光投向了细胞外基质（ECM）中嵌入的一类新型细胞外囊泡（EVs）——基质结合纳米囊泡（MBVs）。这些MBVs位于ECM支架上，因其独特的位置和对非降解性核酸（尤其是miRNAs）的保护作用而区别于传统的EVs。MBVs被认为是促进ECM-细胞通讯、通过靶向递送生物活性物质（如RNAs、蛋白质、酶和脂质）调节细胞功能的关键功能成分，并具有良好的生物相容性和低免疫原性。因此，本研究推测脂肪来源的MBVs（Adipo-MBVs）是脂肪ECM自发成脂特性的关键功能成分，并旨在探索其应用潜力。
本研究由Mmi Xu、Jianwei Chen、Yi Sun、Han Yang、Hongli Ji、Tao Xu、Feng Lu和Yunfan He组成的团队完成，发表于《Journal of Advanced Research》。研究团队从两种脂肪ECM（化学脱细胞基质AAM和机械浓缩基质ACF）中提取了Adipo-MBVs（分别称为C-AT-MBVs和M-AT-MBVs），并比较了它们的特性和功能。为了实现在体内的持续递送，研究人员设计了一种新型复合系统：将负载Adipo-MBVs的聚多巴胺（PDA）涂层HAMA微球（PDA@HMs）嵌入到AAM-HAMA（A/H）杂化水凝胶中。随后，通过体外和体内实验（小鼠模型）评估了该复合系统以及不同来源Adipo-MBVs在促进脂肪组织形成方面的能力，并初步探讨了其潜在机制，重点关注了miRNA cargo及相关信号通路。
为开展本研究，研究人员应用了几个关键技术方法：首先，从人吸脂术获得的脂肪组织中，通过化学脱细胞或机械浓缩两种不同方法制备脂肪ECM，进而通过胶原酶消化和差速离心分离出C-AT-MBVs和M-AT-MBVs。其次，利用毛细管微流控平台制备了单分散的HAMA微球（HMs），并通过多巴胺聚合反应在其表面形成聚多巴胺（PDA）涂层，得到PDA@HMs，用于MBVs的吸附和缓释。第三，将AAM预凝胶与HAMA预凝胶以及MBVs负载的微球混合，构建了可注射的复合杂化水凝胶系统。此外，研究还综合运用了透射电子显微镜（TEM）、纳米颗粒跟踪分析（NTA）、纳米流式细胞术（NanoFCM）对MBVs进行表征；通过油红O染色、管形成实验、细胞划痕实验等评估成脂、成血管和细胞迁移能力；通过高通量miRNA测序和生物信息学分析比较了两种MBVs的miRNA差异；并利用蛋白质印迹（Western blot）验证了相关信号通路蛋白的表达变化。
表征C-AT-MBVs和M-AT-MBVs
研究人员成功从化学脱细胞脂肪组织（AAM）和机械浓缩脂肪ECM（ACF）中分离出C-AT-MBVs和M-AT-MBVs。透射电子显微镜（TEM）显示两者均呈现典型的EV“杯状”形态。纳米颗粒跟踪分析（NTA）表明两者粒径主要分布在200纳米以下，但M-AT-MBVs的产量显著高于C-AT-MBVs（约7.1倍）。纳米流式细胞术（NanoFCM）分析显示两者在囊泡表面标志物CD9、CD63和CD81的表达上存在差异。
M-AT-MBVs增强hADSCs的成脂和迁移以及HUVECs的血管化和迁移
体外实验表明，与C-AT-MBVs相比，M-AT-MBVs能更有效地诱导人脂肪源性干细胞（hADSCs）的成脂分化（通过油红O染色和PPAR-γ（过氧化物酶体增殖物激活受体γ）基因表达证实）和细胞迁移。同时，M-AT-MBVs也表现出更强的人脐静脉内皮细胞（HUVECs）管状结构形成诱导能力和细胞迁移促进能力。
MBV缓释微球（HMs或PDA@HMs）的表征
研究成功制备了单分散的HAMA微球（HMs），并通过PDA涂层得到PDA@HMs。表征显示PDA@HMs具有均匀的涂层和多孔结构。降解实验表明PDA@HMs具有更持续的降解动力学。吸附和释放曲线证实PDA涂层显著增强了微球对MBVs的吸附能力和缓释性能（可持续释放超过22天）。细胞相容性实验证明HMs和PDA@HMs均具有良好的生物相容性。
开发并表征用于移植实验的可注射MBV缓释微球负载杂化水凝胶
为解决单纯AAM水凝胶交联慢、力学性能不足等问题，研究人员开发了由AAM预凝胶、HAMA预凝胶和MBVs负载微球（PDA@HMs）组成的杂化水凝胶（A/H）。该水凝胶系统结合了AAM的成脂生物活性和HAMA的光交联快速成型特性，表现出良好的可注射性和流变学性能。体外共培养实验证实，负载M-AT-MBVs的复合水凝胶（A/H/M-AT-MBV-PDA@HMs）在促进hADSCs成脂和迁移、以及HUVECs成管和迁移方面均优于其他对照组（包括负载C-AT-MBVs的组）。
在杂化水凝胶移植物中，M-AT-MBV缓释微球增强体内成脂和血管生成
动物实验（小鼠皮下移植模型）显示，与其他组（A/H/HMs, A/H/PDA@HMs, A/H/C-AT-MBV-PDA@HMs）相比，A/H/M-AT-MBV-PDA@HMs组移植物在8周观察期内保留了更高的体积，并表现出更显著的脂肪组织形成（通过H&E（苏木精-伊红）染色和perilipin（脂滴包被蛋白）免疫荧光染色证实）和更丰富的血管生成（通过CD31（血小板-内皮细胞粘附分子）免疫荧光染色证实）。实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析显示，A/H/M-AT-MBV-PDA@HMs组移植物中成脂关键调节因子PPAR-γ、CEBP-α（CCAAT/增强子结合蛋白α）和FABP-4（脂肪酸结合蛋白4）的mRNA表达水平也显著上调。
miR-143/MAPK通路参与M-AT-MBV介导的杂化水凝胶移植物脂肪组织构建
机制探索方面，高通量miRNA测序和生物信息学分析发现M-AT-MBVs和C-AT-MBVs具有不同的miRNA表达谱。与C-AT-MBVs相比，M-AT-MBVs中62个miRNAs显著上调，136个miRNAs显著下调。其中，已知具有促成脂作用的miR-143在M-AT-MBVs中显著富集。基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析提示差异miRNAs与MAPK（丝裂原活化蛋白激酶）等信号通路相关。蛋白质印迹（Western blot）分析进一步证实，与A/H/C-AT-MBV-PDA@HMs组相比，A/H/M-AT-MBV-PDA@HMs组移植物中MAPK信号通路关键分子（ERK（细胞外信号调节激酶）、JNK（c-Jun N-末端激酶）、p38）的磷酸化水平下调。这表明M-AT-MBVs可能通过其富含的miR-143抑制MAPK信号通路，从而促进脂肪组织形成。
综上所述，本研究成功鉴定出Adipo-MBVs是脂肪ECM微环境中发挥再生功能的关键效应分子。研究证实，源自机械浓缩ECM的M-AT-MBVs在诱导成脂和血管生成方面优于源自化学脱细胞基质的C-AT-MBVs。研究人员进一步开发了一种新型复合递送系统，实现了M-AT-MBVs在体内的持续释放，并显著促进了血管化脂肪组织的再生。该研究的意义在于实现了从使用整个基质材料到应用明确纳米级功能组分的范式转变，为软组织工程和再生医学提供了新的见解和更有效的策略。尽管在规模化生产、长效安全性评估以及机制深入验证等方面仍面临挑战，但这项研究为开发下一代软组织再生疗法奠定了坚实的基础。
