基于纳米泡对比增强超声的CAR-T细胞体内实时追踪新技术及其在实体瘤治疗中的应用研究

《Nanoscale Horizons》：In vivo tracking of CAR-T cells in tumors via nanobubble-based contrast enhanced ultrasound

本文介绍了一种创新的CAR-T细胞体内追踪技术：通过纳米泡（NB）标记联合对比增强超声（CEUS）实现无创、实时监测细胞分布。该方法利用可内化至CAR-T细胞的纳米级超声造影剂，克服了现有成像技术（如MRI、PET）成本高、有辐射或穿透浅的局限，为优化实体瘤的CAR-T治疗提供了安全、经济且可临床推广的监测方案。

　　

新概念

本研究提出了一种纳米医学新策略：利用纳米尺寸超声造影剂无创追踪CAR-T细胞的可行性。该方法解决了理解CAR-T细胞在实体瘤环境中浸润和定位的关键挑战。与现有非侵入性CAR-T细胞追踪方法（常受限于高成本、可及性差、细胞活性降低或依赖辐射）相比，该技术结合纳米泡与超声，提供了一种经济、安全且广泛可用的替代方案。通过纳米泡在CAR-T细胞内的内化，本研究建立了一种基于超声的免疫细胞追踪创新方法，展示了纳米技术如何改善CAR-T细胞疗法，特别是在克服实体瘤治疗挑战方面的潜力。

引言

嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）疗法是一种先进的过继性细胞疗法（ACT），已显著影响免疫治疗领域。CAR-T疗法利用患者自身的T细胞，已开发出多种FDA批准的产品，用于治疗B细胞恶性肿瘤和多发性骨髓瘤。然而，在实体瘤治疗中，CAR-T疗法的成功尚未复制，其受限因素包括免疫抑制性肿瘤微环境、靶向/非肿瘤毒性、T细胞耗竭、肿瘤异质性、向肿瘤的运输不良以及CAR-T细胞持久性不足。为了解CAR-T细胞在实体瘤中疗效有限的因素，并优化剂量参数同时减轻神经毒性和细胞因子释放综合征等副作用，需要研究细胞输注后的生物分布和向靶标的运输。

目前临床可用方法不足以评估CAR-T细胞在器官和肿瘤中的实时运输模式，而这对于评估疗效和调整策略至关重要。标准监测方法依赖间歇性抽血，但无法揭示体内生物分布和细胞运动。实时追踪可更全面理解CAR-T细胞与肿瘤微环境的相互作用。尽管MRI、PET和光学成像等技术已用于细胞追踪，但各有缺点：MRI时间分辨率低、成本高；PET有辐射且空间分辨率有限；光学成像穿透深度浅。对比增强超声（CEUS）作为一种非电离、低成本、深穿透且高时空分辨率的模态，显示出潜力。超声造影剂（UCA），如由脂质壳和C₄F₁₀气体核心组成的纳米泡（NB），可被细胞高效内化，从而标记细胞用于追踪。本研究旨在利用NB标记的CAR-T细胞，通过超声成像实现其体内实时监测。

材料与方法

从健康供体外周血单核细胞（PBMC）中分离T细胞，使用CD19 CAR慢病毒载体进行基因修饰。纳米泡按照已发表方案制备，使用C₄F₁₀气体以增强稳定性，其强度加权直径约为293.52 ± 50 nm。CAR-T细胞与NB共孵育（比例如20k NBs/细胞）后，通过非线性对比（NLC）超声模式在体外琼脂糖模型和体内NCG小鼠模型（含RAJI淋巴瘤肿瘤）中进行成像。体内成像在输注后0、5、15、30、45、60和75分钟进行，并通过流式细胞术和组织学验证细胞分布。

结果与讨论

体外评估表明，NB标记的CAR-T细胞在超声下产生显著NLC信号，检测阈值低至10³细胞/mL，灵敏度高于其他技术。信号在24小时内逐渐衰减，20k NBs/细胞浓度下信号持久性最佳。在健康小鼠肝脏中，输注后NLC信号平均增加13倍，随后在75分钟内逐渐下降，反映细胞经肝脏的瞬时运输。在RAJI肿瘤模型中，肿瘤区域信号在输注5分钟内达到峰值，并持续高于基线至75分钟，表明CAR-T细胞在肿瘤内浸润和滞留。流式细胞术显示，肿瘤小鼠肾脏、肝脏和血液中CAR-T细胞数量均高于健康对照，与成像信号一致。组织学分析显示CD3+ CAR-T细胞在肾脏和肿瘤中的分布，且细胞数量与NLC信号显著相关（r2 = 0.3999, p = 0.0368）。机制研究表明，NB通过巨吞饮作用（macropinocytosis）被CAR-T细胞内化，抑制剂EIPA可降低荧光和NLC信号。功能实验证实，NB标记不影响CAR-T细胞的增殖、活力、分化或体内抗肿瘤活性。

结论

本研究证实了基于NB和超声的CAR-T细胞体内追踪技术的可行性。该方法可实时监测细胞分布动态，为优化治疗策略提供了有价值的手段。尽管信号随时间衰减和组织异质性等挑战存在，但该技术结合两种FDA批准的方法，具有明显的临床转化潜力，可推动CAR-T疗法在血液恶性肿瘤和实体瘤中的精准应用。