《Advanced Science》：Amodiaquine Enhances Anti-Melanoma Efficacy of Attenuated Salmonella via Targeting Glutathione Reductase in Neutrophils
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本综述系统阐述了减毒沙门氏菌VNP20009（VNP）在黑色素瘤治疗中通过招募肿瘤微环境（TME）中的中性粒细胞（主要为促瘤N2亚型）影响疗效的新机制。研究发现抗疟药阿莫地奎（AQ）可选择性清除TME中性粒细胞，其通过靶向谷胱甘肽还原酶（GR）抑制还原型谷胱甘肽（GSH）合成，降低中性粒细胞对活性氧（ROS）的耐受性，从而在高ROS的TME中诱导中性粒细胞凋亡。研究进一步构建携带GR短发夹RNA（shGR）的工程菌VNP-shGR，通过特异性抑制TME中性粒细胞GR表达增强VNP抗肿瘤效果，为细菌疗法联合药物重定位提供了新策略。
VNP在黑色素瘤治疗中诱导肿瘤微环境中性粒细胞招募
研究首先评估了减毒沙门氏菌VNP20009（VNP）对黑色素瘤模型小鼠的治疗效果。结果显示VNP能显著抑制荷瘤小鼠的肿瘤生长，表现为肿瘤体积增长减缓、肿瘤倍增时间延长以及实验终点肿瘤重量减轻。组织学检测发现VNP治疗组肿瘤组织出现大面积坏死区域。值得注意的是，VNP治疗同时引起了肿瘤微环境（TME）中中性粒细胞的显著招募。通过检测中性粒细胞标志蛋白弹性蛋白酶（ELANE）和髓过氧化物酶（MPO）的表达，证实VNP处理后肿瘤组织中中性粒细胞水平明显上调。流式细胞术、免疫组化和免疫荧光分析进一步表明，VME中中性粒细胞比例显著增加。特别值得注意的是，VNP招募的中性粒细胞主要为N2（促瘤）亚型，这可能会削弱VNP的抗肿瘤疗效。
中性粒细胞促进肿瘤进展并减弱VNP的抗黑色素瘤疗效
在细胞水平上，VNP招募的中性粒细胞显著促进了黑色素瘤细胞的增殖、迁移、侵袭和人脐静脉内皮细胞（HUVEC）的管腔形成。机制上，这些中性粒细胞通过分泌白细胞介素-8（IL-8）、基质金属蛋白酶-9（MMP-9）和血管内皮生长因子-α（VEGF-α）等促瘤因子促进肿瘤进展，同时通过吞噬RFP标记的VNP直接清除细菌。在动物模型中，使用中性粒细胞清除抗体（抗Ly6G）降低TME中性粒细胞水平后，VNP对黑色素瘤的抑制效果显著增强，且VNP在肿瘤组织中的定植量增加。然而，抗体治疗也导致肝脾中细菌载量升高，引起体重下降和肝脾肿大等毒副作用，这可能是由于抗体系统性清除中性粒细胞（包括外周血、肝脾中的中性粒细胞）所致。
AQ通过选择性清除TME中性粒细胞增强VNP抗肿瘤疗效
考虑到小分子抑制剂阿莫地奎（AQ）具有抑制中性粒细胞的活性，研究将其与VNP联用于黑色素瘤治疗。细胞毒性实验显示AQ对中性粒细胞和B16F10黑色素瘤细胞均有杀伤作用，且中性粒细胞更为敏感。在荷瘤小鼠模型中，AQ单药抗肿瘤效果较弱，但与VNP联用能显著增强对黑色素瘤的抑制作用。重要的是，AQ的加入未引起明显毒副作用，且能选择性增加VNP在肿瘤组织中的定植而不影响其他器官的细菌水平。进一步机制研究表明，AQ能特异性降低TME中性粒细胞水平，而对外周血、肝脾中性粒细胞无显著影响。亚型分析显示AQ对中性粒细胞的杀伤作用无亚型选择性，但由于VNP治疗后TME中主要为N2中性粒细胞，因此AQ清除的主要是促瘤性N2亚型。
基于活性蛋白质分析（ABPP）技术鉴定AQ在中性粒细胞中的靶点
为阐明AQ抑制中性粒细胞的分子机制，研究合成了AQ探针（AQ-P），通过化学生物学结合定量蛋白质组学方法筛选AQ在中性粒细胞中的蛋白靶点。竞争性实验证实AQ-P与AQ具有一致的蛋白靶点。质谱鉴定发现10个潜在靶蛋白，其中代谢相关酶谷胱甘肽还原酶（GR）和乙醛脱氢酶2（ALDH2）被选作进一步研究对象。分子对接模拟证实了AQ与GR或ALDH2的直接相互作用。通过抑制剂实验验证，GR抑制剂LCS3能显著降低中性粒细胞对AQ的敏感性，而ALDH2抑制剂Daidzin无此效果，表明GR是介导AQ中性粒细胞毒性的关键靶点。
AQ通过直接结合GR抑制其活性从而降低中性粒细胞ROS应激耐受
研究证实AQ-P能浓度依赖性结合纯化的GR蛋白，且高浓度AQ可竞争性抑制此种结合。细胞热转移实验显示AQ显著增强GR热稳定性，证实二者存在直接相互作用。GR酶活性检测发现AQ能浓度依赖性抑制GR催化活性。由于GR催化氧化型谷胱甘肽（GSSG）还原为GSH，是细胞抗氧化防御的核心酶，研究进一步检测了AQ对中性粒细胞GSH和ROS水平的影响。结果显示AQ能剂量和时间依赖性地降低细胞内GSH比例，升高ROS水平。在低浓度H2O2（可上调中性粒细胞ROS水平但不影响细胞活力）刺激下，AQ对中性粒细胞的细胞毒性作用增强，表明AQ通过抑制GR活性降低了中性粒细胞对ROS的耐受性。鉴于TME中ROS水平较高，而肝脾组织中ROS水平较低，AQ能选择性诱导TME中性粒细胞凋亡，而对肝脾中性粒细胞影响较小。ROS清除剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）能显著逆转AQ诱导的中性粒细胞清除，进一步证实ROS水平是决定AQ选择性细胞毒性的关键因素。
工程化VNP菌株通过靶向中性粒细胞GR增强抗黑色素瘤疗效
基于VNP可作为生物递送载体的特性，研究构建了携带GR shRNA的工程菌VNP-shGR，旨在通过抑制中性粒细胞GR表达增强VNP抗肿瘤效果。体外实验证实VNP-shGR能浓度和时间依赖性地抑制中性粒细胞GR转录和表达，且对RAW264.7巨噬细胞无显著毒性。在黑色素瘤模型中，VNP-shGR和VNP联合LCS3均能增强VNP抑瘤效果，且VNP-shGR效果更显著，同时不引起严重不良反应。机制上，VNP-shGR能特异性增强细菌在肿瘤部位的定植，促进肿瘤靶向，而不影响肝脾中的细菌载量。重要的是，VNP-shGR和VNP联合LCS3能显著抑制VNP诱导的TME中性粒细胞招募，且对中性粒细胞的清除无亚型选择性。组织毒性评估显示两种治疗方案均未引起明显组织学毒性，且能改善VNP引起的肝肾功能损伤。
讨论与展望
本研究揭示了VNP治疗通过招募N2型中性粒细胞削弱其抗肿瘤疗效的新机制，并发现AQ通过靶向GR降低中性粒细胞ROS耐受性，从而选择性清除TME中性粒细胞。工程菌VNP-shGR通过靶向GR增强VNP疗效的策略，为优化细菌疗法提供了新思路。未来研究可进一步探讨中性粒细胞与其他免疫细胞（如T细胞、NK细胞、巨噬细胞等）的相互作用对VNP疗效的影响，以及如何在保持疗效的同时进一步提高治疗安全性。
