《Advanced Science》：Mechanical Overloading-Induced Nanomineral Crystal Perturbation from the Osteochondral Interface: A Potential Initiator of Osteoarthritis
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本文揭示了机械超负荷通过诱导骨软骨界面纳米矿物晶体碎裂及异位沉积，进而引发软骨基质矿化并驱动骨关节炎（OA）进展的新机制。研究结合多物种模型（兔、人、猪等）及高分辨技术（TEM、Raman、AFM等），首次绘制了OA软骨从纳米到微观尺度的时空病理演化图谱，证实界面矿化是OA的早期事件，并发现纤维连接蛋白（fibronectin）和玻连蛋白（vitronectin）介导的细胞-基质机械信号转导是推动病理性矿化级联反应的关键桥梁。该研究为OA的早期干预提供了新的靶点和理论依据。
纳米-微观结构与成分在OA发展过程中的特征
骨关节炎（OA）软骨样本取自四种不同动物及OA患者。以前椎间盘移位（ADD）诱导的兔颞下颌关节骨关节炎（TMJOA）模型髁突为代表，根据国际骨关节炎研究学会（OARSI）评分分为正常、OA早期（OA-E）和OA晚期（OA-A）阶段。研究发现，正常样本表层胶原纤维紧密排列，可见横向条纹，而中层和深层纤维在软骨细胞周围呈现疏松、随机排列。OA-E样本深层纤维间出现散在针状矿物晶体，表层和中层保持完整。OA-A样本软骨侵蚀明显，深层矿化表现为球状体、钙化纤维和致密沉积物，表层纤维降解成碎片，中层纤维重新排列成紧密的束状。类似的结构变化在人类、猪、大鼠和小鼠的TMJOA髁突以及啮齿类动物膝OA样本中均被观察到，验证了OA软骨纳米-微观结构变化的跨物种和跨关节普适性。
成分分析显示，正常样本中胶原（1247 cm?1）从表层向深层递减，而糖胺聚糖（GAGs, 1490 cm?1）递增。OA-E样本深层出现磷酸盐矿物沉积（960 cm?1
负载能量耗散的时空差异响应纳米-微观结构和成分变化
纳米压痕（针尖半径8.5 μm）显示正常髁突软骨的杨氏模量从表层到深层递增。OA-E阶段，表层和中部模量保持稳定，而深层模量因早期矿化显著增加。OA-A阶段，深层矿化扩展导致刚度急剧升高，中层略有增加，表层模量因降解而下降。原子力显微镜（AFM）纳米压痕（针尖半径50 nm）在纤维水平解析了细胞外基质（ECM）刚度异质性。正常软骨刚度随深度增加，OA-E深层刚度急剧升高，OA-A深层刚度达到峰值，中层增加，表层下降。OA-E和OA-A样本深层刚度分布较正常更宽。这些变化导致深层能量耗散增加，表层耗散减少。
OA可能始于骨软骨界面的自下而上矿化
骨软骨界面是矿物质分布边界和机械负荷传递的枢纽。胶原杂交肽（F-CHP）染色显示，OA-E阶段三重螺旋损伤首先发生在界面处，由机械应力集中诱导。Von Kossa和阿尔新红染色显示钙沉积渐进性增加。TEM和拉曼 mapping 显示正常样本中存在结构矿化梯度，表现为邻近软骨的狭窄矿物前沿区和高度矿化的基区。OA-E破坏了这种空间组织，使微裂纹和碎片化纳米晶体侵入软骨基质。OA-A阶段，矿物沉积进一步扩展至深层软骨，形成钙化斑块和增厚的矿物带。扫描电镜-能量色散X射线光谱（SEM-EDS）证实OA中界面增厚，支持自下而上的矿化模式。纳米晶体形态分析揭示了不同的矿化模式。正常样本两区均显示均匀的矿物堆积和空隙，OA-E样本前沿区为碎片化针状晶体，基区为压实材料伴较小空隙，OA-A前沿区为较大不规则聚集体伴空隙形成增加，基区保持致密堆积但空隙更细、分布均匀。
病理性矿化源于界面衍生的纳米晶体碎裂和异位沉积
OA中的病理性矿化通过纳米级晶体扰动启动，经历三个不同的微区。高分辨透射电镜（HRTEM）/SAED分析显示：正常样本晶体尺寸逐渐增大（i区：3±0.5 nm；ii区：8±1.2 nm），iii区为融合结构；OA-E样本包含碎裂纳米晶体，尺寸减少40±5%，但晶格完整性保留（d-间距0.344±0.002 nm）；OA-A样本呈现无定形前体簇和超矿化晶体，尺寸增加210±15%，长宽比2.8±0.3。EDS定量证实OA-E与正常组Ca/P比相当，而OA-A样本Ca/P比显著升高。拉曼光谱证实碳酸盐取代的羟基磷灰石占主导，OA-E具有更高的碳酸盐掺入和更低的矿化度，OA-A则为高矿化度伴碳酸盐取代减少。这些成分变化与机械性能改变相关，包括细胞周基质刚度增加和软骨细胞粘附增强。
钙化基质小泡（MVs）介导晚期矿化
为探索OA-A矿化起源，进一步分析了骨软骨界面前方的肥大软骨细胞。研究发现钙化MVs通过自噬过程介导晚期OA的病理性矿化。TEM分析显示OA-A样本中肥大软骨细胞被致密矿物基质包裹，HRTEM/SAED鉴定出细胞内HAP纳米晶体。EDS定量显示MVs膜含有Ca、P和O，Ca/P比从OA-E的0.56±0.04增至OA-A的1.45±0.10。免疫荧光显示OA-A自噬流中断，LC3+上调，α-微管蛋白减少。这些发现建立了MVs介导的矿化与肥大软骨细胞自噬在OA进展中的直接关联。
纤维连接蛋白和玻连蛋白桥接早期病理性矿化与进展
在OA-E中，深层软骨基质的矿物扰动导致肥大软骨细胞ECM刚度显著增加。蛋白质组学分析显示，OA-E软骨中57种蛋白上调，其中纤维连接蛋白和玻连蛋白在ECM相互作用蛋白中上调最显著。KEGG通路分析显示ECM相互作用和粘着斑通路激活，表明对矿物诱导刚度增加的机械敏感反应。免疫荧光验证了这些蛋白的阶段依赖性上调。细胞骨架分析显示OA-E软骨细胞在ECM接触位点附近形成具有膜皱褶的 elongated processes，伴随微管解聚。这些结构变化与自噬小泡形成相关，建立了连接基质矿化与细胞矿化反应的机械转导通路。
机械超负荷通过纤维连接蛋白上调驱动病理性矿化
为验证体内软骨OA进展中机械超负荷介导的微观结构变化及其对病理性矿化的调控，进行了体外猪TMJ髁突软骨栓加载培养。结果证实机械超负荷（1.5 MPa）在5天内诱导了类OA矿化模式，其特征包括：自界面自下而上的矿物进展、表层纤维解聚、以及反映体内OA的微观结构变化。超负荷条件在24小时内引发界面扰动，深层基质层出现纳米晶体沉积，而表层/中层保持完整。免疫荧光显示伴随的纤维连接蛋白上调和α-微管蛋白下调。界面旁的肥大软骨细胞在1.5 MPa负载下积累矿物晶体。
消除超负荷可逆转矿化并缓解OA进展
从上述微观分析视角，发现OA的关键在于机械超负荷介导的骨软骨界面不稳定和界面衍生纳米晶体碎片的异位沉积。病理性软骨矿化从骨软骨界面起始，向覆盖的软骨发展，并进一步恶化软骨的微观表型。因此，为研究OA的逆转，使用椎间盘复位手术模型消除关节超负荷。结果显示，移位的椎间盘复位后，软骨矿化显著减少，界面趋于完全重建。覆盖软骨的TEM图像显示中层软骨纤维恢复无序排列，表层纤维定向为连贯射线模式。同时，骨软骨界面区域软骨细胞的形态和结构逐渐恢复稳定，钙化小泡的分泌显著减少。组织学和矿物分布分析显示，椎间盘复位后OA软骨也被逆转，矿物分布宽度显著减小。MMP-13和核心蛋白聚糖被认为是基质降解和胶原定向调控的关键蛋白。OA发展过程中，免疫组化染色显示MMP-13在表层逐渐增加，而核心蛋白聚糖在中层显著减少。然而，在椎间盘复位模型中观察到相反的趋势。
总之，本研究提供了证据表明骨软骨界面纳米矿物晶体的扰动可能参与OA发展中病理性软骨矿化的启动，可能影响疾病相关纳米-微观尺度组织改变的出现。深层ECM中纳米晶体的沉积诱导了机械刚度增加，从而触发了软骨细胞的机械感应。随后，钙化MVs的释放被促进，并进一步推动了ECM的自下而上矿化和OA进展。
