《Journal of Photochemistry and Photobiology A: Chemistry》：Serendipitous discovery of nitrogen bridgehead fused pyridines: pHotophysical properties and live-cell imaging potential
编辑推荐：
本刊推荐：针对新型荧光探针匮乏制约生物成像技术发展的瓶颈问题，研究人员偶然发现了一种合成氮桥头融合吡ridine (NBFP) 的新方法。该研究系统探讨了NBFP类化合物的pH依赖性光物理性质，并筛选出甲基噻唑衍生物1和喹啉衍生物8作为环境敏感型细胞内探针，证实其具备大斯托克斯位移(>100 nm)和荧光寿命变异性，为活细胞成像和细胞内传感提供了新型荧光骨架。
在生物医学研究领域，荧光成像技术如同给科学家配备了一副"分子显微镜"，能够实时观察细胞内的生命活动。然而，这副"显微镜"的成像质量很大程度上取决于荧光探针的性能。当前荧光探针开发面临两大挑战：一是缺乏理性设计方法，新骨架发现多依赖偶然性；二是现有探针往往难以兼顾大斯托克斯位移、远红光发射和环境敏感性等关键特性。特别是能够对细胞内pH值等生理参数变化做出响应的"智能型"探针尤为稀缺。
正是在这样的背景下，来自Jo?ef Stefan研究所的研究团队在尝试合成噻唑衍生物时，意外发现了一个发出绿色荧光的副产物，这一偶然发现引领他们走进了一个全新的荧光染料世界——氮桥头融合吡啶(NBFP)。这项发表于《Journal of Photochemistry and Photobiology A: Chemistry》的研究，不仅报道了一种简便高效的NBFP合成方法，还系统评估了这类化合物的光物理性质及其在活细胞成像中的应用潜力。
研究团队采用了几项关键技术方法：通过单晶X射线衍射确证化合物结构；使用荧光光谱仪和紫外-可见分光光度计系统表征光物理性质；利用小鼠II型肺泡上皮细胞(LA-4)进行活细胞成像实验；结合共聚焦显微镜和荧光寿命成像(FLIM)技术分析探针的细胞内分布和环境敏感性；采用MTS和PrestoBlue法评估细胞毒性。
研究结果与发现：
化学合成与结构表征
研究人员首先阐明了NBFP的意外形成机制：在合成噻唑A的过程中，副产物1通过DMF在酸性条件下的活化环化而形成。通过系统优化反应条件，发现使用4当量盐酸在60°C反应2天效果最佳，收率达83%。该方法成功拓展至多种芳基乙腈和2-(杂芳基)乙酸酯，合成了10个NBFP衍生物。单晶X射线衍射分析清晰揭示了化合物5、7和10的分子结构，证实了氮桥头融合的吡啶核心骨架。
光物理性质
所有合成的亚胺衍生物(1-8)均表现出显著的pH敏感性荧光，斯托克斯位移多数超过100 nm。其中化合物1在pH 3.0时最大吸收波长404 nm，发射波长522 nm，荧光量子产率达0.34；化合物8则展现出红光发射特性(吸收461 nm，发射589 nm)。值得注意的是，化合物1和7在生理pH 7.4下仍保持较高荧光强度，而化合物8仅在酸性条件下(pH < 6)发出强荧光，这一特性使其特别适合酸性细胞器标记。
显微成像应用
活细胞成像实验显示，化合物1和8能够快速标记细胞内的囊泡结构，但与商业溶酶体探针Lysotracker Red的共定位有限。化合物1仅部分定位于溶酶体，而化合物8则主要标记非溶酶体结构。进一步研究发现，化合物1具有低背景荧光、高光稳定性和低细胞毒性的优点，适合长时间活细胞成像。荧光寿命成像分析表明，化合物1的荧光寿命对溶剂极性高度敏感(非极性溶剂中6 ns，极性溶剂中1.5 ns)，而受粘度和pH影响较小，提示其可作为细胞内极性传感探针。
结论与意义
本研究开发了一种简单高效的NBFP合成方法，为荧光探针库增添了新成员。虽然化合物1和8未能实现特异性溶酶体标记，但它们表现出的环境敏感性荧光特性，特别是化合物1对极性变化的响应能力，为开发新型细胞内微环境传感探针提供了新思路。这些发现不仅丰富了我们对NBFP类化合物构效关系的认识，也为后续设计更精准的细胞器靶向探针奠定了坚实基础，推动荧光成像技术向更高时空分辨率和功能多样性方向发展。
