粪肠球菌CTB来源双糖酶GenA的生化特性表征及其在生物催化中的潜在应用

《Food Science & Nutrition》：Biochemical Characterization of a Disaccharidase From Enterococcus faecalis CTB

本文推荐一篇关于粪肠球菌（Enterococcus faecalis）CTB菌株来源的双糖酶GenA的生化特性研究。该研究通过异源表达和纯化，系统评估了GenA的底物特异性、动力学参数（Km和Vmax）、最适温度（40°C–60°C）与pH（7.5–9.0），以及金属离子（如MgCl2的激活作用）对酶活性的影响，揭示了其在麦芽糖、乳糖和纤维二糖水解中的高效催化潜力，为工业生物技术应用提供了新见解。

　　

分子克隆与重组表达

研究成功从粪肠球菌CTB菌株中克隆得到GenA基因，并将其异源表达于大肠杆菌BL21-Codon Plus (DE3)系统中。通过镍柱亲和层析、离子交换层析和尺寸排阻层析等多步纯化，获得纯度高于95%的重组GenA蛋白。SDS-PAGE和Western blot分析确认其分子量约为54 kDa，且在溶液中以单体形式存在。

底物特异性与动力学分析

GenA展现出对多种二糖的水解活性，包括麦芽糖、乳糖和纤维二糖，但对蔗糖无活性。动力学研究表明，麦芽糖为其最适底物（Km = 0.27 ± 0.05 mM，V_max= 33.8 ± 2.24 μM/min），其次为乳糖（Km = 0.42 ± 0.04 mM，V_max= 42.0 ± 2.91 μM/min）和纤维二糖（Km = 0.47 ± 0.06 mM，V_max= 51.0 ± 1.90 μM/min）。此外，GenA还能水解合成底物如PNP-α-D-葡萄糖苷和PNP-β-D-半乳糖吡喃苷，显示其催化底物的多样性。

最适温度与pH特性

GenA的催化活性受温度和pH影响显著，且具有底物依赖性。麦芽糖水解的最适温度为40°C，乳糖为50°C，纤维二糖为60°C；最适pH分别为7.5、8.5和8.0–9.0。酶在20–60°C和中性至弱碱性条件下稳定性较高，但在极端温度（>70°C）或强酸/强碱环境中活性急剧下降。

金属离子对酶活性的调控

Mg²⁺对所有测试底物均表现出显著激活作用（活性提升2.0–4.0倍），而Ni²⁺和Mn²⁺则普遍抑制酶活性。这一现象提示Mg²⁺可能在稳定酶构象或参与催化过程中发挥关键作用。

讨论与展望

GenA作为一种来源于益生菌的双糖酶，其广泛的底物特异性和可调节的催化条件展示了在食品工业、医药生物技术等领域的应用潜力。后续研究可聚焦于其三维结构解析、理性设计改造以及在实际工业流程中的效能验证，以进一步挖掘其生物催化潜力。