《Environmental DNA》：Consistent Species Richness Patterns but Not Richness Estimates Based on Both ASV and OTU Inference Methods on ITS2-Based Soil Fungal Communities
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这篇综述系统比较了扩增子序列变体（ASV）和操作分类单元（OTU）两种聚类方法在ITS2标记的土壤真菌群落分析中的表现。研究表明，尽管两种方法在总体物种丰富度模式上高度一致，但ASV能捕获更多种内遗传变异，导致更高的γ多样性估计；而OTU在揭示群落与环境因子（如土壤N:C比）的生态关联时更具优势。文章强调方法选择需结合研究目标，反对ASV完全替代OTU的绝对化观点。
引言
真菌在生态系统中承担关键功能，但其群落常隐藏于土壤或有机质中，难以直接观察。基于环境DNA的宏条形码技术通过聚类序列读取单元（如OTU或ASV）来解析群落结构。本研究以瑞典森林土壤Inventory的359个样点为基础，利用PacBio平台测序ITS2区域，对比ASV（通过DADA2推断）和OTU（基于99%相似度的单链接聚类）两种方法对真菌群落表征的影响。
材料与方法
数据处理流程：原始序列经质量过滤后，分别通过SCATA管道（OTU聚类）和nf-core/ampliseq管道（ASV推断）处理。OTU聚类采用单链接算法，最小相似度阈值为99%；ASV推断通过DADA2去噪并利用LULU算法进一步校正潜在人工序列。代表性序列通过UNITE数据库（v9.0）进行物种假设（SH）注释，序列相似度阈值设为98.5%。统计分析使用R语言vegan包，评估α多样性（如Shannon指数）、β多样性（Bray-Curtis相异度）及群落与环境因子的关联（PERMANOVA）。
结果
1. 数据产出与分类注释
ASV方法生成4572个单元，比OTU（3229个）多42%，但ASV流程过滤了2.3%的低质量读取。ASV在属和种水平的注释比例更高（属：78% vs. 69%；种：63% vs. 46%）。所有ASV代表性序列均能与OTU序列匹配（相似度≥92.2%），但11%的OTU（均为稀有类群，<0.1%总读取量）未匹配到ASV，表明OTU能保留部分ASV过滤的稀有变异。
2. 物种丰富度估计
两种方法在样点水平的α多样性相近（ASV: 115±38 vs. OTU: 122±42），但ASV的γ多样性外推值高达25,730±1832，是OTU（3535±32）的7.3倍，且未达渐近线。ASV将同一SH拆分为多个变体（平均1.5 ASVs/SH），如Piloderma sphaerosporum（SH0943263.09FU）被分为8个ASV，而OTU仅对应2个单元，反映ASV对种内变异的高分辨率。
3. 生态关联分析
ASV与OTU的群落结构显著相关（Mantel检验r>0.95），但OTU数据与土壤N:C比的相关性更强（PERMANOVA：OTU的R2=0.040 vs. ASV的R2=0.025）。LULU校正虽减少ASV数量（4208个），但未改变总体趋势。
讨论
ASV和OTU在揭示真菌群落宏观模式上具有一致性，但ASV因保留种内变异而高估γ多样性，OTU则通过聚类近似物种水平的单元更易捕捉生态驱动因子（如N:C比）。ASV适用于解析微进化过程，而OTU在生态学研究中有更高效率。方法选择应取决于研究目标，而非简单替代。未来需结合更完善的参考数据库优化SH注释，以平衡分类分辨率与生态解释力。
