嗜盐碱产乙酸菌Haloacetibacter carboxydivorans的发现及其碱性条件下一氧化碳发酵产甲酸的独特代谢机制研究

《Environmental Microbiology Reports》：Carboxydotrophic Acetogenesis in Alkaline Conditions Results in Transient Formate Production by the Halo-Alkaliphilic Acetogen Haloacetibacter carboxydivorans Gen. Nov. sp. Nov

本研究首次报道了从高盐碱性生物反应器中分离得到的新型嗜盐碱产乙酸菌Haloacetibacter carboxydivorans，该菌在碱性条件下通过Wood-Ljungdahl途径（WLP）将一氧化碳（CO）转化为乙酸和甲酸，其中甲酸作为新型氧化还原平衡机制替代传统乙醇生产，基因组和转录组分析揭示了其独特的NADH依赖性甲酸脱氢酶和分岔氢化酶系统。

　　

1 引言

厌氧条件下的一氧化碳（CO）转化已被广泛报道于产甲烷菌、产乙酸菌和产氢菌中。然而目前分离的大多数羧化营养型产乙酸菌来源于肠道或淡水环境，最适pH范围集中在4-7之间，这限制了对中性及弱酸性条件以外产乙酸羧化营养生理机制的理解。嗜盐碱性系统（以高浓度碳酸钠/碳酸氢盐和 elevated pH 为特征）是产乙酸羧化营养研究中相对未被充分探索的环境。尽管存在双重极端条件（高盐度和pH），这些环境中仍存在广泛的微生物生理活动。

目前已知能在高于1 M钠浓度和pH >8条件下进行羧化营养产乙酸作用的分离株仅有Alkalibacter mobilis和Natranaerofaba carboxydovora。与中性条件下主要产生乙醇作为还原力溢出产物的经典羧化营养菌不同，碱性环境因低质子浓度限制了关键氧化还原平衡反应（如质子还原产氢和乙酸还原为乙醇）的热力学可行性。本研究报道了一株从高盐碱性CO喂养生物反应器污泥中分离的新型嗜盐碱性羧化营养产乙酸菌MD4，其生理特征显示该菌能以CO为底物产乙酸和甲酸，而不产生氢或乙醇。

2 实验方法

2.1 培养基与微生物培养

菌株MD4的富集和分离在碳酸盐缓冲培养基（pH约9）中进行。培养在密封玻璃瓶（总容积121 mL或250 mL）中进行，培养基体积50 mL。生物反应器培养采用1.5 L Applikon反应器，在批次模式下运行，通过质量流量控制器供应CO和N₂，pH值通过3 M KOH维持在9。

2.2 接种源与微生物分离

接种源来自一个连续运行的实验室规模生物反应器，该反应器在pH 9、1.5 M钠浓度下运行，以CO和H₂为底物处理含25 mM硫酸盐和12.5 mM硫代硫酸盐的进水。经过三轮CO上的系列稀释后，利用含5 g/L琼脂的嗜盐碱性培养基进行软琼脂瓶培养，成功分离出菌株MD4。

2.3 菌株特征分析

菌株特征分析在密封玻璃瓶中进行，以葡萄糖为底物测试温度（5°C至90°C）、pH（6.5至10）和底物利用范围。钠浓度和金属耐受性测试在96孔板中进行厌氧培养。

2.4 分析技术

采用高效液相色谱（HPLC）分析有机酸和醇类，离子色谱（IC）分析硫酸盐、硫代硫酸盐和硝酸盐，气相色谱（GC）分析H₂、CO和CO₂。通过Spectroquant试剂盒测定溶解的铜、铁和锰浓度。

2.5 基因组与转录组学分析

通过PacBio RS II平台进行基因组测序，使用Falcon v.0.3进行组装。利用Illumina Novoseq 6000平台进行RNA测序。使用GTDB-Tk v1.5.0进行系统发育分析，TYGS服务器进行数字DNA-DNA杂交（dDDH）分析。

3 结果

3.1 菌株MD4的富集与分离

从运行在pH 9、1.5 M钠浓度和1 M碳酸盐浓度的CO喂养生物反应器中获得CO氧化富集物。经过三轮CO上的系列稀释后，甲烷生成不再被检测到，而乙酸和甲酸生产仍然存在。通过软琼脂培养成功分离出菌株MD4。

3.2 菌株MD4的系统发育

基于16S rRNA基因序列同一性，菌株MD4的最接近亲缘关系是Alkalibacter mobilis（92.6%）。全基因组分类学将菌株MD4置于Alkalibaculum和Alkalibacter属之间的一个新分支。平均氨基酸同一性（AAI）分析和数字DNA-DNA杂交（dDDH）支持菌株MD4代表一个新属。

3.3 菌株MD4的生理与形态

菌株MD4为革兰氏阳性杆菌，细胞长度1-5 μm，偶尔形成链状。在CO上生长时，产生乙酸和甲酸作为唯一发酵终产物，不产生氢或乙醇。甲酸在CO浓度低时被部分共消耗。在连续CO供应的生物反应器中，甲酸产量显著高于乙酸。菌株MD4能利用多种糖类，但不能利用醇类、脂肪酸或其他C1底物。

3.4 环境因子对生长和金属耐受性的影响

菌株MD4在15°C至40°C（最适35°C–37°C）、pH 7–10（最适8–9）和钠浓度0.01–2.5 M（最适0.8–1.2 M）范围内生长。碳酸盐浓度增加促使发酵谱向甲酸生产转变。铜、镍和钴的耐受浓度分别为低于0.039 mM、低于0.6 mM和低于1.25 mM。观察到CO驱动的铜还原现象，但主要归因于非生物过程。

3.5 功能基因组学与转录组学

菌株MD4基因组大小为2.4 Mbp，GC含量38.4%。基因组编码完整的Wood-Ljungdahl途径（WLP）和糖酵解途径。鉴定出一个NAD依赖性甲酸脱氢酶和五个推测的分岔氢化酶/氧化还原酶复合物基因簇。转录组分析显示，WLP相关基因和CODH相关基因高表达。两个推测的分岔氢化酶（ACIVAZ_00290和ACIVAZ_08475）高表达。丝氨酸和甘氨酸合成途径相关基因高表达，检测到培养基中存在微量甘氨酸。

4 讨论

菌株MD4代表了一类新的嗜盐碱性羧化营养产乙酸菌。在碱性条件下，甲酸生产替代乙醇作为氧化还原平衡机制，可能与碳酸氢盐可用性和相关反应的热力学有关。转录组数据支持NAD依赖性甲酸脱氢酶和分岔氢化酶在甲酸代谢中的潜在作用。菌株MD4对广泛环境条件的适应性表明其可能来源于盐池或经历蒸发事件的环境。系统发育和基因组分析支持其作为Alkalibacteraceae科中新属的代表。

5 分类学

基于系统发育基因组分析和表型特性，提议将菌株MD4分类为新属和新种Haloacetibacter carboxydivorans，归属于Alkalibacteraceae科。该菌为厌氧产乙酸菌，革兰氏阳性杆菌，嗜盐碱性，中温生长，发酵糖类或CO产乙酸和甲酸。模式菌株为MD4^TDSM 119686。