《Global Ecology and Biogeography》：Cross-Continental Ecological Drivers Behind Trait Clines in the Forest Grass Milium effusum
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本文通过同园栽培实验，比较了广泛分布的林下禾草粟米草(Milium effusum)在欧洲和北美原产地种群的性状变异格局。研究发现，尽管两大洲种群占据的气候生态位部分重叠，但其多变量性状空间存在显著差异。关键生物气候变量（而非简单的纬度或海拔）主导了开花物候、叶片厚度、比叶面积(SLA)等性状的平行进化cline，暗示了相似的选择压力；而营养株高和生物量则表现出大陆特异的演化轨迹。本研究为理解跨大陆物种在相似环境梯度下的表型变异机制提供了新视角，揭示了遗传、环境和进化因素的复杂互作。
1 引言
宏观气候在大陆内部存在广泛变异，并与地理因素相关，这反映在全球植被带分布上。从亚历山大·冯·洪堡对气候（尤其是温度和降水）在解释植被带中关键作用的认识到查尔斯·达尔文提出的自然选择和适应机制，先贤的见解至今仍适用于探究植物分布的全球模式。广泛分布的物种会遇到各种气候条件和环境梯度，可能导致种内性状沿地理范围出现梯度变异（Clines）。这些Clines可能是表型可塑性、中性非适应性进化（如遗传漂变）或通过自然选择的适应性进化共同作用的结果。
当来自广泛地理或环境梯度的植物在相同条件下栽培时，可能揭示出基于遗传的种内性状Clines，这可以表明由原产地生物气候条件或其它环境因素驱动的适应性进化。通过比较远距离种群间的种内性状-环境关系，可以检验相似环境的选择压力是否导致了相似表型的平行进化，从而为这些Clines的适应性本质提供证据。相反，分化的Clines可能表明对独特环境条件的独特进化适应，或中性进化过程。
许多研究利用纬度、海拔等代理变量成功解释了性状变异。然而，纬度和海拔仅是那些最终构成塑造性状变异选择压力的环境变量的代理。为了促进对导致性状变异空间格局机制的理解，应识别潜在的选择因子，特别是与温度和降水相关的因子，它们是影响表型分化和驱动快速性状适应的重要选择力。
具有广泛地理分布的物种，特别是那些跨区域或大陆存在分布间断的物种，为检验平行适应性进化提供了独特机会。迄今为止，大多数跨大陆种内Clines研究集中于近期引入的外来或入侵物种，比较其原生与非原生范围内沿相似梯度的进化变化模式。尽管这些基于外来物种近期引入的案例对于记录快速或短期进化过程很有价值，但引入和殖民过程中的遗传瓶颈可能会强烈影响甚至抑制新殖民范围内的进化过程或结果。因此，对在两个大陆均为本地的物种进行跨大陆比较，将构成对响应相似环境梯度的性状Clines平行进化的更好检验。
研究长时期Clines平行进化的理想系统是粟米草(Milium effusum L.)，一种广泛分布的禾草物种，原生于欧亚大陆和北美大陆。该物种被归类为环极北方-温带植物区系成分的成员，这是一组在中高纬度地区有原生分布区的植物物种。系统发育数据表明，粟米草谱系约在1600万年前从相关禾草中分化出来。先前的研究表明，欧洲粟米草种群存在纬度Clines。本研究将地理范围扩展到涵盖其欧洲和北美分布区，具体目标包括：(1) 使用与北美和欧洲粟米草分布范围相关的温度和降水环境变量，研究两大洲之间的气候生态位重叠；(2) 通过同园栽培实验比较两大洲种群的性状Clines；(3) 将同园栽培获得的性状数据与源种群所跨越的环境梯度联系起来。
2 方法
2.1 研究物种
粟米草是林下禾草，株高50-150厘米，花期取决于其地理范围内的纬度和海拔位置。种子没有特殊的传播适应，但偶尔通过动物体内外传播进行长距离传播。从匍匐基部长出茎以及扁平、光滑、无毛的叶片和叶鞘。通过短匍匐茎重新发芽在多年生中起作用，对于具有一定克隆性的粟米草而言，营养生长可被视为适应度代理。粟米草是耐阴物种，主要生长在温带落叶林下，但也可能出现在草甸、铁路和公路沿线以及岩石生境中。其原生分布范围涵盖北半球大部分地区，包括欧洲大部分地区、北美部分地区和亚洲部分地区。欧洲存在二倍体(2n=14)和四倍体(2n=28)种群，而北美种群的倍性水平未知。
2.2 实验设计
2021年，从粟米草在两个区域分布区的23个欧洲种群和14个北美种群收集了种子。在每个种群内，从10-15个随机选择的个体（以下称为种子家系）收集种子。2021年11月，从每个种群的10-15个采样个体中随机选择5-8个种子家系进行同园栽培实验。将每个种子家系的25粒种子播种到5个1.5升盆中，置于德国法兰克福的同园内。盆被放置在遮荫棚下，模拟森林上層遮荫。定期浇水以维持粟米草自然生境的典型湿润土壤条件。
2.3 性状测量
在2021年12月至2022年3月期间，每周记录三次幼苗出土情况。当植株在第二个生长季（2023年春季）达到生殖成熟时，在整个4月和5月每周记录三次开花起始期。在开花高峰期测量营养性状。在每个盆中，计数分株数以及基于五粒播种种子的开花分株比例。测量营养高度（最长叶）和生殖高度（最长花序分株）。随机选择每个盆中的三片叶子，使用SPAD仪测量叶绿素含量相对值，使用千分尺测量每片叶的叶片厚度，使用天平测量三片叶的总鲜重，使用“Easy Leaf Area”应用程序测量三片叶的总叶面积。叶片鲜重称重后，在60°C下干燥48小时，然后测定干重。根据上述测量计算三片叶的平均比叶面积(SLA；叶面积/干重)和平均叶片干物质含量(LDMC；干重/鲜重)作为植物资源利用的指标。最后，在2023年7月中旬，将每盆整个地上部分生物量在土壤表面以上1厘米处收获，室温干燥1周，然后在60°C下干燥48小时，称重。
2.4 统计分析
首先，从WorldClim数据库提取37个欧北美种子源种群点的19个生物气候变量，使用30年平均值(1970-2000)来测试气候与种群和大陆间功能性状变异模式之间的关联。进行主成分分析(PCA)来描述种子源点之间以及粟米草欧北美分布区之间的关键气候变异方面。提取PC1和PC2的得分用于后续分析。PC1的前五个生物气候变量载荷是最干月降水量、最湿季度平均温度、降水季节性、最干季度平均温度和和最湿月降水量。PC2的前五个载荷是平均日较差、最冷季度降水量、最暖季度平均温度、最冷月平均温度和和最暖季度降水量。
其次，可视化整个欧洲和北美大陆（即背景条件）以及基于提取的GBIF出现记录的粟米草整个地理范围的气候空间。计算Schoener's D度量来量化粟米草在北美和欧洲分布区之间的环境生态位重叠。还计算了每个大陆上出现点所占据的可用PCA空间（PC1和PC2）的比例，以及欧洲出现点与北美重叠的比例，反之亦然。
第三，对所有10个测量的生态和功能性状（发芽开始、开花开始、营养高度、生殖高度、开花分株比例、LDMC、SLA、SPAD、叶片厚度和地上生物量）进行PCA，以研究来自37个欧北美种子源种群的粟米草植株所覆盖的多变量性状空间。应用perMANOVA检验多变量性状空间的大陆差异。
最后，为了研究表型Clines与由37个种子源种群点的PC1和PC2得分所代表的环境梯度的关系，进行了10个独立的线性混合效应模型(LMMs)。模型公式中的固定效应包括PC1、PC2、大陆及其双向交互项，同时将采样种群的原始纬度和海拔位置作为协变量纳入固定效应。将种子家系嵌套在种群来源内作为随机截距项。
3 结果
3.1 地理范围与生态位重叠
生物气候PCA表明，PC1主要捕获与更湿更暖环境相关的变异，而PC2代表与更大日较差以及更暖湿季节相关的梯度。比较粟米草在欧北美之间的气候生态位，估计Schoener's D度量得分为0.429。欧洲出现点主要与中低PC2值相关，对应于较小平均日较差、最冷季度较高降水和较大季节温度的条件。北美种群独特地分布在低PC1和高PC2得分区域。北美种群占据的环境生态位明显窄于欧洲种群，后者表现出更广泛的气候出现。具体而言，粟米草在北美占据的气候空间占该大陆总可用气候空间的15.7%，而在欧洲的分布范围填充了欧洲整个可用气候空间的73.5%。欧洲环境生态位与北美生态位的74.8%重叠，而北美生态位仅与欧洲生态位的22.0%匹配。
3.2 大陆表型差异
性状PCA揭示了多变量性状空间的显著大陆差异（perMANOVA: R2=0.167, F?,???=151.51, p=0.001）。PC1解释了20.1%的观测变异，主要特征为开花分株比例和开花开始期。PC2解释了16.0%的观测变异，主要特征为生殖高度和叶片厚度。来自欧洲的个体比北美个体发芽和开花显著更早（分别早约30天和3天）。欧洲个体的LDMC、营养高度、生物量和开花分株比例显著更大，而北美个体的叶片厚度、SLA和生殖高度显著更大。SPAD没有显著大陆差异。
3.3 环境对跨大陆Clines的影响
开花开始期与生物气候PC1、纬度和海拔显著相关，表明来自更湿暖环境、更高纬度和更低海拔的个体在两个大陆上都开花更早。叶片厚度与生物气候PC1和PC2呈负相关，来自更湿暖气候以及更大日较差、更暖季节和更湿冬夏环境的个体总体叶片更薄。SLA与生物气候PC2呈正相关。开花分株比例与纬度呈正相关，来自北纬度的个体具有更高数量的生殖结构。营养高度与生物气候PC1呈正相关，同时与大陆存在交互作用，导致来自更湿暖环境的北美个体营养高度较低，而欧洲个体差异较小。生殖高度与PC1显著负相关，来自更冷、季节性更弱和更干条件的个体长出更高的生殖分株和花序。生物量与PC1、PC2、大陆、PC1与大陆的交互作用以及纬度显著相关。具体而言，来自更暖湿气候的欧洲个体生物量更大，而来自更冷、季节性更弱和更干条件的北美个体产生更多生物量。然而，来自两个大陆更气候稳定环境的个体也产生更多生物量，并且两个大陆的个体随着纬度增加产生更大生物量。未发现PC1、PC2或纬度对发芽开始期、SPAD或LDMC有影响。
4 讨论
4.1 地理范围与生态位重叠
粟米草的大部分地理范围位于西欧亚大陆，其气候特点是高降水和中等温度季节性；相比之下，北美东部种群出现在具有更高温度、降水和季节性变异的大陆性区域。尽管确定了两个大陆之间的中度气候重叠，但欧洲范围所暗示的可用生态位空间的大部分在北美仍未殖民，表明欧洲种群具有北美种群不共享的额外气候耐受性，或者可能由有限传播或生理限制引起的范围填充受限。此外，支撑粟米草在欧洲广泛分布的一些生物气候生态位空间在北美缺乏。另一个可能的解释是，虽然已知粟米草在欧洲存在两个倍性水平，但北美可能只存在一个倍性。众所周知，当存在多个倍性水平时物种具有更大的地理范围，并且多倍体通常比其二倍体祖先具有更大的分布范围。最后，也可以认为北美种群经历了瓶颈，可能失去了一些重要的遗传变异，限制了物种响应新环境条件的能力，或者 simply 位于西海岸/太平洋西北部的未占据生态位空间区域由于跨越大片非森林生境的巨大传播障碍而无法从北美东部殖民。
4.2 大陆表型差异
研究显示了多变量性状空间中显著的大陆差异。生殖分配、与生长策略相关的性状和结构投资决定了大陆间的性状分化。欧洲种群比北美种群发芽和开花显著更早。叶片厚度、SLA和LDMC在两个大陆之间显著差异。北美个体叶片更厚，这可能与光合作用、水分利用效率和净生产力等主要生理过程相关。此外，北美个体的高SLA结合低LDMC表明优先考虑快速生物量生产，而欧洲个体的低SLA和高LDMC可能表明优先考虑养分保存。最终，这表明北美个体可能更倾向于采取竞争策略，而欧洲个体更耐胁迫，可能是两个大陆上不同生物和竞争环境的结果。
对于粟米草，生物量、营养高度和开花分株比例可被视为适应度代理，因此欧洲个体更大的性状平均值可能表明与经历更新奇气候环境的北美个体相比，在欧洲同园中对环境条件适应更好或具有适应性可塑性反应。营养保存策略将使欧洲个体能够随时间利用资源并积累更多总生物量和对生殖结构的更大投资，导致更多分株达到生殖阶段。相比之下，北美个体更大的生殖高度可能反映了它们对花粉和种子传播或其他与生殖成功相关益处的优先考虑。此外，如果我们假设北美个体是单一倍性，而在欧洲存在二倍体和四倍体，倍性水平差异也可能导致观察到的大陆差异，这强调了在未来研究中确定倍性水平的重要性。
最后，重要的是要注意，由于本实验在同园中进行，我们可以假设在不同种群和大陆间观察到的表型差异是基于遗传的。然而，一些观察到的表型差异也可能由假定的种群大小差异驱动。较小的北美种群更容易因遗传漂变、近交或有限基因流而面临潜在遗传风险。此外，粟米草在欧洲更广的地理范围可以为欧洲种群提供更大的表型变异，这是由于更广的范围和遇到的环境条件的多样性。
4.3 环境对跨大陆Clines的影响
生物气候变量解释了大多数观察到的性状-环境关系，解释了12个显著关系中的9个，而纬度和海拔分别只贡献了2个和1个关系。发现营养高度和生物量都受到生物气候PC1与大陆交互作用的显著影响，表明当来自更暖湿气候时欧洲个体长得更高更大，而北美个体体型较小。这里，对比的Clines可能暗示相同选择压力下不同的进化结果。
大多数显著的Clinal性状模式在两个大陆之间共享相同方向（开花开始期、叶片厚度、SLA、生殖高度和生物量），并且大陆间相似的斜率表明相同的环境变量可能导致在两个大陆上朝向相同Clines的进化。先前比较原生和引入/入侵种群的研究发现了营养性状的强纬度和环境Clines，表明两大洲物候和生长相关性状的快速进化朝向相似Clines。最终，我们的研究物种粟米草可能独立进化出相似Clines以响应两个不同大陆的环境条件。研究粟米草跨大陆模式的关键下一步是进行 reciprocal transplant，以进一步研究本地适应，包括原位性状测量。
5 结论
总之，本研究强调了粟米草多变量性状空间的显著大陆差异以及种群起源生物气候变量的影响。尽管存在适宜的气候条件，粟米草在北美有限的分布引发了关于历史传播轨迹和潜在瓶颈的问题。此外，来自种群起源的环境影响揭示了平行Clines，表明欧洲和北美响应相似选择压力的趋同或平行进化。有趣的是，某些性状在欧北美之间存在对比Clines的证据可能暗示对相似非生物因素的不同进化解决方案，或其他此处未考虑的生态因素（如区域多样性和竞争环境差异）的压倒性影响。未来关注倍性水平的研究对于理解粟米草在不同生物地理背景下的进化动态和生态策略至关重要。总体而言，本研究强调了遗传、环境和进化因素在塑造广泛分布的跨大陆森林物种表型变异中的复杂互作。
