《Journal of Pineal Research》：Pinopsin Regulates Melatonin Production and Daily Locomotor Activity: Functional Insights From Gene-Edited Xenopus Tadpoles
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本文系统阐述了Pinopsin在脊椎动物（尤其两栖类）昼夜节律光感受中的进化与功能。研究通过基因编辑技术证实，Pinopsin在非洲爪蟾蝌蚪松果体中与褪黑素合成关键酶AANAT共定位，通过抑制光照期褪黑素分泌调控皮肤色素变化（p<0.0001），并影响昼夜运动模式。该研究为理解非哺乳动物脊椎动物昼夜节律的光调控机制提供了关键证据。
3.1 Pinopsin基因在进化中多次独立丢失但在大多数无尾目基因组中保守存在
进化分析显示，Pinopsin在脊椎动物多个谱系中经历独立丢失，包括哺乳类（合弓类）、部分爬行类（如蛇和鳄鱼）及硬骨鱼，但在鸟类、龟类、蜥蜴和非硬骨鱼类中保留。对95种两栖动物的基因组调查表明，Pinopsin在蝾螈和大多数无尾类中高度保守，而在许多盲螈（蚓螈目）中缺失，这可能与其穴居生活方式和有限的光照暴露有关。
3.2 阶段46/47非洲爪蟾蝌蚪中光/暗色素沉着和行为的褪黑素介导变化受光敏感松果体调节，独立于眼睛
在发育阶段46/47的蝌蚪中，通过切除眼睛实验证实，皮肤色素变化（通过色素指数评估）和昼夜运动活动（在12小时光/12小时暗周期下记录）仅依赖于松果体的光敏感性，而与眼睛无关。切除眼睛的蝌蚪在光照期皮肤更暗（模拟黑色背景适应），但仍在暗期出现褪黑素诱导的皮肤变亮，表明该反应是眼独立的，依赖于光敏感松果体。运动活动分析显示，蝌蚪在光照期活动增加，切除眼睛后仍保持这种昼夜运动模式，进一步证实松果体是主要的光传感器。
3.3 Pinopsin与褪黑素合成酶Aanat在松果体细胞中共表达，其蛋白水平在暗期升高
免疫组织化学显示，Pinopsin在非洲爪蟾蝌蚪的松果体细胞中与褪黑素合成限速酶AANAT共定位（超过90%的Pinopsin阳性细胞同时表达AANAT），但不表达于神经纤维相关抗原（NAA）阳性的投射神经元。蛋白水平检测发现，Pinopsin在暗期（ZT+18）的表达量显著高于光照期（ZT+6），表明其蛋白积累具有昼夜节律性，可能为感知光信号以同步内部时钟做准备。
3.4 Pinopsin调控褪黑素相关的色素变化
利用CRISPR/Cas9技术构建F0代Pinopsin基因敲除蝌蚪，证实敲除效率达90%，且不影响蝌蚪的总体形态（尾长、头部大小、眼间距）。表型分析发现，敲除蝌蚪在光照期（ZT+6）皮肤色素指数显著降低，与野生型在暗期的色素水平相似，表明Pinopsin缺失导致光照期褪黑素抑制功能丧失。色素指数与Pinopsin表达水平呈正相关，支持其通过调控褪黑素水平影响色素沉着。
3.5 Pinopsin缺失影响光/暗行为相关的运动表现
运动行为分析表明，Pinopsin敲除蝌蚪仍能区分光暗周期，但光照期的总运动距离显著减少，而最大运动速度未受影响，说明运动功能本身无损伤。这种活动减少可能是由于光照期褪黑素分泌失调导致的嗜睡反应。结果提示，Pinopsin在调节日常行为中起重要作用，但光暗相行为的部分保留表明可能存在其他光敏感视蛋白的功能冗余。
3.6 阶段47蝌蚪缺乏昼夜节律色素沉着和运动活动反应
将阶段47蝌蚪从光暗周期（LD）转换为恒定光照（LL）或恒定黑暗（DD）后，皮肤色素指数在ZT+6和ZT+18无显著差异，运动活动的光暗模式也消失。表明该发育阶段的蝌蚪对环境光暗线索有反应，但缺乏内源性昼夜节律。这阻碍了评估Pinopsin在昼夜节律中的作用，但证实其参与光暗响应。
4 讨论
研究表明，Pinopsin在大多数两栖动物中保守存在，其缺失与低光环境适应（如盲螈）相关。功能上，Pinopsin在松果体中与AANAT共表达，通过光抑制褪黑素合成，调控皮肤色素变化和运动活动。基因敲除导致光照期褪黑素抑制失效和运动减少，证实其在非哺乳动物光感受中的关键作用。其他视蛋白（如黑视蛋白）可能共同参与调节，揭示了脊椎动物昼夜节律光感受机制的复杂性。
