酒精戒断会通过激活雄性小鼠梨状皮层中的谷氨酸能神经元，从而引发类似焦虑的行为

《Progress in Lipid Research》：Alcohol withdrawal promotes anxiety-like behavior via activating glutaminergic neurons in the piriform cortex of male mice

本研究建立小鼠酒精戒断模型，通过开放场和 elevated plus maze 测试评估行为表型，并利用免疫荧光和 chemogenetic 方法探讨 PC 中 VGLuT1 神经元的作用，发现该神经元活性变化与戒断焦虑和运动抑制相关，提示其为潜在治疗靶点

　　

张新蕾|徐晨|于思|颜安|彭珊|马英杰|乔小萌

郑州大学基础医学院病理学与法医学系，中国河南省郑州市科学大道100号，450001

摘要

酒精戒断综合征在临床上表现为焦虑、疲劳、情绪失调和睡眠障碍，严重损害了身体和心理健康。虽然这些行为表现与边缘系统功能障碍有关，但其背后的神经机制尚不完全清楚。在本研究中，我们建立了酒精戒断的小鼠模型。通过开放场地测试（OFT）和升高平台迷宫（EPM）定量评估了行为表型。通过免疫荧光共定位分析检测了每个脑区中的c-fos表达以及梨状皮层（PC）中的NPY、PV和VGLuT1神经元的表达。随后在VGLuT1-Cre小鼠中特异性抑制或激活PC中的VGLuT1神经元，并分析了行为变化。结果表明，小鼠在酒精戒断3天后表现出类似焦虑的行为和活动能力下降，同时PC中的VGLuT1神经元活性增加。抑制或激活PC中的VGLuT1神经元分别可以减少或增强类似焦虑的行为和活动能力下降。这些发现表明，3天的酒精戒断会激活PC中的VGLuT1神经元，从而导致活动能力下降和类似焦虑的行为。

引言

长期过量饮酒后突然停止或减少饮酒通常会导致戒断综合征，其特征是震颤、疲劳、情绪失调和睡眠障碍，严重影响生理和心理健康（Alexiou和King，2023；Kádár等人，2024）。值得注意的是，伴随戒断出现的负面情绪状态——尤其是抑郁和焦虑症状——不仅是复发风险的关键因素（Kokhan等人，2022），也对酒精使用障碍（AUD）的临床管理构成了重大挑战（Gowing等人，2015）。酒精通过与多种神经递质系统的复杂相互作用发挥其作用，破坏了抑制性和兴奋性信号之间的平衡（Mukherjee等人，2008），从而调节神经元兴奋性（Li等人，2024；Thompson等人，2023）。长期饮酒会导致深刻的神经适应性变化，包括大脑结构和功能的变化、神经退行性和神经元凋亡（Anand等人，2023）。停止饮酒后，这些神经适应性变化会导致中枢神经系统出现适应性不良反应，表现为情绪障碍，包括焦虑。在神经回路层面，酒精戒断通过激活腹侧被盖核的神经元并随后调节腹侧被盖区（VTA）中的多巴胺D1和D2受体活性，促进类似抑郁的行为（Fu等人，2019）。此外，戒断还会激活内侧前额叶皮层（mPFC）中的特定GABA能和促肾上腺皮质激素释放因子（CRF）神经元，这可能是执行功能和工作记忆受损的原因（Dominguez等人，2016；George等人，2012）。激活小鼠的CA1或CeA区域可以显著缓解酒精戒断引起的焦虑和绝望情绪（Duratkar等人，2024；Patel等人，2021）。总体而言，这些发现表明，酒精戒断行为主要源于边缘系统回路的失调。

边缘系统在调节与酒精戒断相关的行为中起着重要作用。在这些结构中，梨状皮层（PC）——位于大脑皮层和脑干之间的边缘系统组成部分——在情绪状态处理、共情行为、记忆形成和恐惧/焦虑反应中起着关键作用（Fang等人，2024；Ikeda等人，2003；Wang等人，2022）。尽管这些功能已被确立，但PC在酒精戒断效应中的潜在作用仍不甚清楚。PC主要由谷氨酸能神经元组成（Large等人，2016），其中GABA能神经元较少，主要分布在第三层（Wang等人，2020）。值得注意的是，PC中谷氨酸能神经元兴奋性的增强和GABA能神经元活性的降低共同调节气味记忆功能（Liu等人，2017）。PC神经元的行为调节严重依赖于它们的神经连接性，因为PC与前嗅核（AON）和腹侧纹状体等多个脑区有直接和间接连接。解剖学上，AON接收来自嗅球的直接输入，并与梨状皮层锥体神经元形成谷氨酸能兴奋性突触，从而介导小鼠的气味学习和反应（Russo等人，2020）。在腹侧纹状体中，嗅球结节（OT）中的D1和D2受体表达神经元接收来自PC谷氨酸能神经元的单突触输入，从而调节气味引起的神经活动（White等人，2019）。这些回路层面的相互作用通过谷氨酸介导的信号传导来调节行为，这也是酒精作用的主要靶点。这些神经解剖学证据表明，酒精戒断可能通过调节PC中的谷氨酸能神经元来产生行为效应。

为了研究PC谷氨酸能神经元在酒精戒断相关行为中的作用，我们提供了10%的酒精溶液供小鼠自由饮用28天，随后进行3天的戒断。我们首先研究了酒精戒断对谷氨酸能神经元活性和行为结果的影响。然后，我们在VGLuT1-Cre小鼠中使用了化学遗传学方法（由设计药物DREADDs特异性激活的设计受体），以选择性地操纵PC谷氨酸能神经元的活性，从而评估神经元激活/抑制与戒断相关行为之间的因果关系。我们的发现揭示了PC谷氨酸能神经元在酒精戒断表型中的关键调节作用，突显了它们作为酒精戒断综合征新治疗靶点的潜力。

实验部分

动物

从辽宁长生生物技术有限公司购买了30只6-8周大的C57BL/6J雄性小鼠。VGLuT1-Cre小鼠来自上海海南模型生物技术有限公司，通过雌雄交配繁殖，共有36只6-8周大的雄性后代用于实验。两组样本的所有行为实验均使用C57BL/6J小鼠。化学遗传学干预实验使用了VGLuT1-Cre小鼠。所有小鼠（每笼4只）被置于明暗循环环境中

酒精戒断降低了小鼠的活动能力并引发了类似焦虑的行为

为了确定能够降低活动能力并引发类似焦虑行为的适当戒断时间，我们在酒精戒断后不同时间点（1天、3天、7天）观察了小鼠的行为。通过OFT观察小鼠的活动能力。图1A显示了酒精戒断后1天、3天和7天的小鼠移动轨迹。双向ANOVA显示，酒精戒断后的时间和总距离有显著影响，且两者之间存在明显交互作用

讨论

大量证据表明，酒精戒断会在啮齿动物模型中引发过度兴奋、癫痫易感性、类似焦虑的行为、运动震颤和抑郁症状（Li等人，2023a；Metten等人，2018）。我们的实验范式涉及3天的酒精剥夺，成功再现了这些典型的戒断症状，表现为OFT运动活动和EPM开放臂探索时间的显著减少。

作者贡献声明

张新蕾：撰写——初稿、方法学、研究、数据管理。徐晨：方法学、研究、数据管理。于思：方法学、研究。颜安：方法学、研究。彭珊：方法学、研究。马英杰：方法学、研究。乔小萌：撰写——审稿与编辑、撰写——初稿、监督、研究、概念化。

出版同意

所有列出的作者均同意提交论文，所有数据的使用均获得了数据生成者的同意。

伦理批准和参与同意

动物实验获得了郑州大学生命科学伦理委员会的批准。

资助

本工作得到了国家自然科学基金（编号82101978）和中国留学基金委（编号202307040065）对X.Q.的支持。

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

致谢

我们感谢郑州大学基础医学院病理学与法医学系的王恒、郑州大学基础医学院Sasa Wang学院以及郑州大学医学院临床医学系的赵玉如在行为测试中的帮助。