小分子HCY-NBD通过Cys174硫化修饰稳定GSTM2以抑制高糖诱导的内皮细胞衰老和钙化

《Redox Biology》：Small molecule HCY-NBD stabilizes GSTM2 via cys174 sulfenylation to attenuate high glucose induced endothelial cell senescence and calcification

本研究针对高糖诱导的血管内皮细胞衰老和钙化这一关键病理过程，发现小分子HCY-NBD能够靶向结合谷胱甘肽S-转移酶Mu2（GSTM2），并通过促进其第174位半胱氨酸（Cys174）发生SO2介导的硫化（sulfenylation）修饰，抑制该位点的K48连接型泛素化降解，从而稳定GSTM2蛋白水平。这一新机制有效延缓了内皮细胞衰老进程并抑制了血管钙化的发生，为防治糖尿病等相关代谢性疾病中的血管老化提供了新的治疗策略和候选化合物。

　　

心血管疾病是全球死亡的主要原因，而血管老化及其导致的动脉硬化是其中的核心病理环节。作为血管结构和功能基石的内皮细胞，其衰老被认为是年龄相关性血管功能障碍的关键驱动因素。特别是在糖尿病等代谢异常状态下，持续的高糖环境会显著加速内皮细胞的衰老和钙化进程，对血管健康构成严重威胁。然而，由于血管内皮细胞微环境的复杂性，针对高糖诱导的内皮细胞衰老和钙化的调控机制尚不完全清楚，亟需开发新的治疗策略。

以往研究表明，补充外源性的谷胱甘肽S-转移酶Mu2（Glutathione S-Transferase Mu 2, GSTM2）是一种有前景的抗衰老策略。但外源递送方法存在技术复杂、稳定性差和生产成本高等限制，因此，探索维持内源性GSTM2蛋白稳态的新方法具有重要意义。与此同时，二氧化硫（SO₂）作为一种新型气体信号分子，在心血管疾病中展现出包括抑制血管钙化在内的多种保护效应，其作用机制与介导蛋白质半胱氨酸残基的硫化修饰密切相关。然而，SO₂介导的蛋白质硫化修饰是否以及如何调控血管内皮衰老仍属未知。

在这项发表于《Redox Biology》的研究中，研究人员发现了一个名为HCY-NBD的小分子，它能够与GSTM2结合，并在高糖条件下稳定GSTM2蛋白水平。机制上，HCY-NBD促进了GSTM2蛋白Cys174位点的硫化修饰，并抑制了该位点的K48连接型泛素化，从而阻止了GSTM2的蛋白酶体降解。细胞实验表明，HCY-NBD能够上调GSTM2并抑制高糖诱导的血管内皮细胞衰老和钙化。在db/db糖尿病模型小鼠中，腹腔注射HCY-NBD同样提高了主动脉GSTM2水平，并减轻了胸主动脉的衰老和钙化表现。这些发现首次揭示了一种通过增强内源性GSTM2稳定性来对抗血管老化的新策略。

研究人员主要运用了分子对接和表面等离子共振（SPR）分析HCY-NBD与GSTM2的结合；通过体外酶活实验检测GSTM2活性；利用点突变、免疫共沉淀和质谱分析确定了关键的Cys174修饰位点及泛素化类型；采用细胞衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）染色、Western Blot检测衰老标志物（p21, p16, p53）以及细胞周期分析评估细胞衰老；通过阿尔新红（Alizarin Red S）染色、Von Kossa染色和碱性磷酸酶（ALP）活性测定评估钙化；并在db/db小鼠模型上进行了体内药效验证。

3.1. HCY-NBD与GSTM2结合并稳定其蛋白水平

通过内部SO₂探针库筛选和相似性集成方法（SEA）预测，研究发现HCY-NBD可能与GSTM2结合。分子对接显示二者具有强结合亲和力（结合能为-7.52 kcal/mol），SPR实验进一步证实了结合，平衡解离常数（K_D）为0.02754 μM。功能实验表明，HCY-NBD不影响GSTM2酶活性，但能在高糖条件下剂量依赖性地逆转GSTM2蛋白水平的下调，而不影响其mRNA水平，说明HCY-NBD通过结合GSTM2来稳定其蛋白。

3.2. HCY-NBD上调GSTM2硫化并抑制其泛素化

HCY-NBD本身是SO₂探针，其稳定GSTM2的效应依赖于其结合的SO₂。研究发现，高糖抑制而HCY-NBD促进GSTM2的硫化修饰。同时，高糖上调而HCY-NBD抑制GSTM2的泛素化，且特异性抑制K48连接型泛素化链的形成，而对其 glutathionylation 修饰无影响。这表明HCY-NBD通过促进硫化来抑制泛素化降解途径。

3.3. Cys174是HCY-NBD调控GSTM2硫化及非赖氨酸泛素化的关键位点

通过点突变和修饰水平检测，研究确定Cys174是HCY-NBD调控GSTM2硫化修饰的关键位点。质谱分析进一步发现Cys174也是GSTM2发生非赖氨酸泛素化的位点。将Cys174突变为丙氨酸后，HCY-NBD无法再抑制GSTM2的泛素化，也无法稳定GSTM2蛋白，其对高糖诱导内皮细胞衰老的保护作用也随之消失。这证明Cys174的硫化修饰是HCY-NBD发挥功能的核心分子事件。

3.4. HCY-NBD抑制高糖诱导的HUVECs衰老

在高糖诱导的人脐静脉内皮细胞衰老模型中，HCY-NBD处理显著降低了衰老相关蛋白p21、p16和p53的表达，减少了G0/G1期细胞周期阻滞，降低了SA-β-gal阳性细胞比例，并提高了细胞内还原型谷胱甘肽（GSH）与氧化型谷胱甘肽（GSSG）的比值，表明其有效缓解了高糖诱导的内皮细胞衰老。利用小干扰RNA（siRNA）敲低GSTM2或转染Cys174突变体质粒，均废除了HCY-NBD的抗衰老作用，证明其效应依赖于GSTM2及其Cys174位点。

3.5. HCY-NBD抑制db/db小鼠血管衰老

在db/db糖尿病模型小鼠中，腹腔注射HCY-NBD（1和5 mg/kg，隔日一次，持续8周）未表现出明显毒性。实验发现，HCY-NBD治疗能显著降低主动脉内皮细胞中衰老标志物p21的表达，增强内皮标志物CD31的信号，减少主动脉组织的SA-β-gal活性，并提高血清GSH/GSSG比值，表明其有效减轻了体内的血管衰老。同时，免疫组化和免疫荧光结果显示，HCY-NBD处理上调了db/db小鼠胸主动脉特别是内皮层的GSTM2蛋白水平。

3.6. HCY-NBD在体外和体内抑制高糖诱导的血管钙化

在高糖诱导的内皮细胞成骨样分化模型中，HCY-NBD处理抑制了成骨关键因子BMP2、BMP4和RUNX2的表达，并减少了钙结节的形成。在db/db小鼠模型中，HCY-NBD治疗降低了主动脉内皮细胞中RUNX2的表达，抑制了血清ALP活性，并显著减轻了胸主动脉的钙化沉积。这表明HCY-NBD不仅能抗内皮衰老，还能抑制由此引发的血管钙化起始过程。

本研究揭示了一条全新的抗血管老化通路：小分子HCY-NBD通过其携带的SO₂，靶向促进GSTM2蛋白Cys174位点的硫化修饰，该修饰竞争性抑制了同一位置发生的K48连接型泛素化，从而阻断了GSTM2的蛋白酶体降解途径。稳定的GSTM2蛋白通过维持细胞氧化还原稳态，有效遏制了高糖引发的血管内皮细胞衰老及其向成骨样细胞分化的趋势，最终延缓了血管钙化的病理进程。这项工作不仅首次报道了GSTM2可通过Cys174的硫化修饰来调控其稳定性，还发现了HCY-NBD这一具有成药潜力的GSTM2小分子激活剂，为防治糖尿病等代谢性疾病相关的血管并发症提供了新的靶点和策略。