《Nature Microbiology》：Babesia divergens host cell egress is mediated by essential and druggable kinases and proteases
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本研究针对巴贝斯虫宿主细胞逸出机制不明、治疗手段有限的问题，通过转录组学、化学遗传学及基因编辑技术，系统鉴定了调控巴. divergens逸出和入侵的关键激酶（PKG、CDPK4）和天冬氨酸蛋白酶（ASP2、ASP3），证实其可作为药物靶点，并筛选出具有治疗潜力的化合物WM382等，为巴贝斯虫病治疗提供了新策略。
巴贝斯虫是一类由蜱虫传播的顶复门寄生虫，可感染人类和家畜的红细胞，引起巴贝斯虫病。近年来，随着人畜共患病例的增加，巴贝斯虫已成为重要的新发传染病病原。当前治疗手段存在疗效有限、耐药性及副作用大等问题，亟需开发新的治疗策略。与疟原虫和弓形虫等顶复门寄生虫相比，巴贝斯虫的细胞生物学研究相对滞后，特别是其从宿主细胞中逸出的分子机制尚不明确。逸出是寄生虫扩散感染的关键步骤，深入解析其调控机制对于开发新型抗寄生虫药物具有重要意义。
为揭示巴贝斯虫逸出过程的分子基础，研究人员以Babesia divergens为模型，综合运用显微成像、转录组学、化学遗传学及基因编辑等技术，系统研究了其逸出和入侵的细胞动力学特征及关键分子调控网络。研究发现，B. divergens的逸出过程与进化上更接近的疟原虫存在显著差异，反而与弓形虫更为相似。例如，B. divergens的逸出过程极为迅速，仅需数秒即可完成，且其运动性依赖于细胞外钙离子的存在。通过建立可诱导的逸出实验体系，研究人员发现cGMP类似物8-Br-cGMP可有效诱导寄生虫逸出，而胞内钙离子螯合剂BAPTA-AM则可完全阻断该过程。
在技术方法上，本研究的关键手段包括：利用流式细胞术进行诱导逸出高通量筛选；通过时间推移显微成像记录逸出和入侵的动态过程；构建同步化转录组和单细胞转录组（样本来源于体外培养的B. divergens寄生虫），解析基因表达时序；建立CRISPR-Cas9基因编辑系统，实现特定基因（如PKG、CDPK4、ASP2、ASP3）的可诱导敲低（使用DD-glmS系统）和点突变（如PKG-T651Q耐药突变）；以及基于小分子抑制剂的化学遗传学验证。
An induced-egress assay to study B. divergens host cell egress and invasion
研究人员建立了基于8-Br-cGMP的诱导逸出系统，发现B. divergens的逸出过程包括红细胞变形、渗透化及寄生虫逃逸等步骤。该过程受cGMP依赖性蛋白激酶（PKG）和钙离子信号调控，且对丝氨酸蛋白酶抑制剂敏感。
Loss of host cell integrity induces B. divergens motility and egress
研究表明，宿主红细胞膜的破裂可激活寄生虫的运动性，该过程依赖于细胞外钙离子，且可被PKG激活剂所绕过。这与弓形虫的逸出机制类似，但不同于疟原虫。
Chemical inhibition of kinases, proteases and calcium signalling all impair egress
通过小分子抑制剂筛选，研究人员发现PKG抑制剂（C1、ML10）、钙依赖性蛋白激酶4（CDPK4）抑制剂以及天冬氨酸蛋白酶（ASP2、ASP3）抑制剂均可显著抑制B. divergens的逸出，证实这些分子在逸出过程中发挥关键作用。
Motility is required for B. divergens merozoites to egress from RBCs but not for RBC permeabilization
细胞松弛素D处理实验表明，寄生虫的运动性对其从渗透化的红细胞中逃逸是必需的，但并非红细胞膜破裂所必需。这提示B. divergens可能通过分泌穿孔素样蛋白（PLP）等裂解因子破坏宿主细胞膜。
Identification of putative egress, motility and invasion genes through transcriptomic analyses
转录组分析揭示了与逸出、运动和入侵相关的基因表达谱，包括PKG、CDPK4、ASP2、ASP3等多个潜在关键基因。这些基因的表达呈现时序性变化，与寄生虫的发育阶段密切相关。
A genetic screen reveals the essentiality of PKG, CDPK4, ASP2 and ASP3 for parasite proliferation
利用CRISPR-Cas9介导的基因敲低系统，研究人员证实PKG、CDPK4、ASP2和ASP3是B. divergens增殖所必需的。敲低这些基因可导致逸出或入侵缺陷，并引发多轮细胞内复制。
PKG and CDPK4 are essential for egress, and their depletion results in additional rounds of intracellular replication
PKG或CDPK4敲低可阻断逸出，导致寄生虫在红细胞内进行多轮复制，形成含多达16个寄生虫的克隆。这表明逸出失败可触发寄生虫进入新的复制周期。
The proteases ASP2 and ASP3 are required for egress and invasion
ASP2和ASP3敲低分别影响寄生虫的入侵和逸出过程。ASP2缺陷型寄生虫可与红细胞结合并变形，但无法完成入侵；而ASP3缺陷型则表现为逸出延迟和入侵失败。
PKG, CDPK4, ASP2 and ASP3 are druggable targets required for egress and/or invasion
化学遗传学验证表明，PKG抑制剂ML10和ASP3抑制剂WM382对B. divergens具有强效抑制作用，且对其他巴贝斯虫种（如B. bovis、B. bigemina）也显示活性，提示其广谱治疗潜力。
本研究系统阐明了B. divergens宿主细胞逸出的分子机制，鉴定出PKG、CDPK4、ASP2和ASP3等关键靶点，并验证了其成药性。这些发现不仅深化了对顶复门寄生虫逸出机制的理解，而且为开发新型抗巴贝斯虫病药物提供了重要靶点和先导化合物。特别是抑制剂WM382和ML10，展现出直接转化应用的潜力，有望解决当前巴贝斯虫病治疗面临的困境。该研究发表于《Nature Microbiology》，为针对寄生虫逸出过程的抗感染药物研发奠定了坚实基础。
