《Sensors and Actuators B: Chemical》：Proximity ligation dependent immuno-PCR assay for sub-pg/mL quantification of protein biomarker
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PRIPA通过近场配体化结合三重锚定策略提升低丰度蛋白检测灵敏度，检测限达0.024 pg/mL，成功应用于血浆p-tau181的阿尔茨海默病早期诊断。
作者：蔡荣凯、徐子颖、邓娟、王凯民、田丹宇、严一琳、孙奋勇、刘庆忠
南京医科大学，中国南京 211166
摘要
低丰度蛋白质的敏感检测对于疾病的早期诊断至关重要，然而传统的化学发光免疫测定方法很少能达到所需的检测限。蛋白质向DNA的信号转导为这一问题提供了解决方案，例如免疫PCR（IPCR）和邻近连接测定（PLA）技术。然而，IPCR受到吸附引起的背景干扰，而PLA则容易发生游离探针的连接反应。本文介绍了一种基于邻近连接的免疫PCR测定方法（PRIPA），该方法建立了一个通用的固相邻近连接框架，仅在抗原验证且结合发生在表面时才允许连接反应发生。分裂DNA报告基因有效地消除了IPCR中的非特异性吸附背景，严格的洗涤步骤抑制了PLA中常见的游离探针连接现象，从而减少了假阳性信号并提高了方法的稳健性。为了在临床背景下验证这一方法，我们使用PRIPA技术对血浆中的p-tau181进行了定量分析。通过三种不同的锚定策略，PRIPA的检测限达到了0.024 pg/mL，线性范围为0.064 – 1000 pg/mL。血浆加标回收实验显示该方法的有效性为99.2–108.4%，特异性测试表明其对非目标蛋白质的识别能力非常强（P < 0.001）。这些结果证明PRIPA是一种稳健且适用范围广泛的分析平台，可用于可靠的亚pg/mL级别蛋白质定量分析，而p-tau181的检测案例充分展示了其在阿尔茨海默病检测中的潜在应用价值。
引言
超灵敏度地定量蛋白质生物标志物对于疾病的早期诊断至关重要，尤其是在阿尔茨海默病（AD）等神经退行性疾病中。例如，血浆中的p-tau181浓度通常低于5 pg/mL [1, [2]，这给分析带来了显著挑战。传统的免疫测定方法（包括化学发光和ELISA）由于信号放大能力有限以及干扰因素的存在，常常无法在这种低浓度下实现可靠的检测。
材料
所有单链DNA、探针、引物、山羊IgG、EDTA（0.5 mM，pH = 8.0）、Tween 20、Triton X-100、KCl、MgCl2、Tris HCl和PBS均购自Sangon Biotechnology（中国上海）。DNA通过高效液相色谱（HPLC）进行纯化，具体信息见表S1。鲑鱼精子购自Sigma（德国达姆施塔特）。p-tau181捕获抗体、NfL检测抗体和GFAP检测抗体均购自Huading Biology。
现有类似免疫PCR技术的性能评估
为了评估PRIPA的性能，我们首先研究了使用传统IPCR和PLA方法检测超低丰度生物标志物（如p-tau181）时遇到的主要障碍。图1总结了这些挑战。在IPCR测定中，我们测试了不同浓度的p-tau181（0 – 5000 pg/mL），以评估检测抗体的非特异性吸附对结果的影响。如图1所示，Ct值随浓度的变化而变化。
结论
我们开发的PRIPA直接克服了基于扩增的免疫测定方法的主要缺陷。通过将邻近连接反应转移到PCR板表面，并采用三种互补的锚定策略（PRIPATAb、PRIPAB-DNA、PRIPAB-Ab），PRIPA结合了IPCR的扩增效率和PLA的双重识别特异性，同时抑制了其固有的背景干扰。这种固相格式实现了稳健的性能、接近理想的线性关系以及可靠的检测结果。
伦理声明
本研究使用了市售的重组蛋白和人类血浆样本。本研究未进行任何专门针对人类或动物的实验。使用血浆样本得到了上海第十人民医院伦理委员会的批准（批准编号25K170），并遵循了《赫尔辛基宣言》的相关规定。
作者贡献声明
蔡荣凯：撰写初稿、验证方法学部分。邓娟：方法学设计、数据管理。徐子颖：撰写、审稿与编辑、项目监督、概念构思。王凯民：数据可视化、形式化分析。严一琳：撰写、审稿与编辑、项目管理、数据管理。田丹宇：软件开发、实验设计。刘庆忠：撰写、审稿与编辑、项目监督、资源协调。孙奋勇：项目监督、资金筹集。
利益冲突声明
作者声明没有已知的可能影响本文研究的财务利益或个人关系。
致谢
本研究得到了国家自然科学基金（项目编号82372701）和上海医院发展中心基金会（项目编号SHDC12026101）的支持。
蔡荣凯于2023年获得广东医科大学学士学位，目前正在南京医科大学攻读硕士学位。他的研究方向是创新低丰度生物标志物的检测方法及其临床应用。
